七鳃鳗——铁代谢研究的极佳模型

七鳃鳗历经5亿年的进化历程,所处的自然环境具有低温及铁含量较高等特点,且在变态发育过程中组织结构和生命机制已经发展出其独特的适应性的进化方式,这为人们进一步研究生命起源和进化提供了新的方向。铁是人体必需的营养素之一,在代谢过程中发挥重要的作用,但当过量时可能导致铁中毒。七鳃鳗体内游离铁含量很高,如变态前幼体的血清铁浓度是人类正常男性的149倍,幼体肝中的铁含量约是人类正常含量的2~3倍。七鳃鳗具有完备的生物化学系统耐受体内高浓度的游离铁,铁稳态的重要基因如转铁蛋白、铁蛋白重链、超氧化物歧化酶等基因高表达,提升了铁转运、铁储存及抗氧化能力。七鳃鳗具有IRE/IRP调控系统,是适应组织内高铁环境的重要保护机制。此外,七鳃鳗在变态发育过程中逐渐形成口腔腺,成为独特的铁代谢器官。本文主要介绍了七鳃鳗各组织铁的分布及适应体内高铁含量的潜在机制,为后续寻找调控铁代谢分子机制提供理论基础。

日本七鳃鳗PAK4参与LPS介导的VLRB类淋巴细胞亚群免疫应答反应

p21活化蛋白激酶4(p21-activated protein kinase 4,PAK4)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与调控多种信号通路,在高等脊椎动物免疫应答中起重要作用。在低等脊椎动物日本七鳃鳗(Lampetra japonica)中发现一个PAK4同源基因(Lja-PAK4),其开放阅读框长度为2544 bp,编码一个含有848个氨基酸的蛋白质。该分子与高等脊椎动物PAK4序列比对一致性最高,且具有该蛋白家族保守的两个功能结构域。利用通过原核表达、纯化的重组Lja-PAK4蛋白为抗原,成功制备了大鼠抗Lja-PAK4的多克隆抗体。用混合菌刺激七鳃鳗,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹方法发现,Lja-PAK4的mRNA和蛋白质在外周血淋巴细胞和髓样小体中均显著性上调表达。采用B细胞丝裂原LPS和T细胞丝裂原PHA分别对七鳃鳗进行刺激后发现,经LPS刺激后Lja-PAK4的mRNA和蛋白质在外周血淋巴细胞和髓样小体中呈现出显著性上调表达,而它们在鳃囊中的表达受到抑制。以上结果说明Lja-PAK4参与了LPS介导的七鳃鳗VLRB+淋巴细胞亚群的免疫应答反应。

七鳃鳗Bam32cDNA分析、抗体制备和免疫表达分析

为探索七鳃鳗(Lampetra japonica)与32 kDB淋巴细胞接头分子(B-cell adaptor molecule of 32 kDa,Bam32)同源的分子Lja-Bam32基因在其免疫应答反应中的作用,利用嵌套PCR方法成功克隆了Lja-Bam32基因开放阅读框的cDNA序列,包含747 bp核苷酸,编码含有249个氨基酸残基的蛋白质。通过多序列比对发现,Lja-Bam32具有该家族两个特征结构域Src同源区2和Pleckstrin同源结构域和两个保守的酪氨酸磷酸化位点。系统发育分析显示,Lja-Bam32与不同物种的Bam32分子位于同一个聚类群,以上结果表明,无颌类七鳃鳗中存在Bam32家族分子。然后通过构建表达载体对Lja-Bam32进行了原核表达,并利用纯化后的重组蛋白成功制备了兔抗Lja-Bam32的多克隆抗体。利用实时荧光定量PCR方法以及免疫印迹方法分别检测了日本七鳃鳗免疫相关组织中Lja-Bam32基因的mRNA及蛋白在混合菌免疫刺激前后的差异表达情况。结果表明,与未免疫组相比,经过混合菌[念珠菌(Candida albicaus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄葡萄珠菌(Staphylococcus cutetvs)]免疫刺激后,Lja-Bam32的mRNA转录表达量在外周血淋巴细胞、鳃囊和髓样小体中显著上调;而该基因的蛋白水平表达量只在淋巴细胞和髓样小体中显著上调,在其他组织中没有明显的变化。由于VLRB+淋巴细胞主要在外周血淋巴细胞和髓样小体组织中分布,推测Lja-Bam32应该与七鳃鳗类B细胞(VLRB+淋巴细胞)的免疫应答反应有关。研究结果为深入研究日本七鳃鳗VLRB+淋巴细胞适应性免疫应答的信号转导分子机制提供了参考。

日本七鳃鳗转化生长因子βⅠ型受体基因(L-Tgfbr1)的克隆与表达分析

作为无颌类脊椎动物的现存代表之一,日本七鳃鳗(Lampetrajaponica)是研究免疫系统起源与进化的重要模型。为了探究TGF-β(Transforming growth factor beta)信号通路在日本七鳃鳗免疫调节中的功能,本研究利用PCR技术克隆了日本七鳃鳗TGF-βⅠ型受体基因(L-Tgfbr1)的编码序列,开放阅读框长度为1335 bp,编码444个氨基酸残基。L-Tgfbr1蛋白含有已知的TGF-βⅠ型受体分子的主要功能结构域,其中位于胞内的丝/苏氨酸激酶催化结构域保守性较高。系统进化树分析表明,L-Tgfbr1处于脊椎动物Tgfbr1蛋白的底端进化枝上,表明其在Tgfbr1进化史中具有原始性地位。实时定量PCR结果发现,L-Tgfbr1在心脏等组织中的转录水平较高。利用脂多糖注入七鳃鳗激活其先天性免疫应答,L-Tgfbr1在肾脏、鳃、髓小体、肝脏、白细胞、口腔腺中的转录水平呈现一过性的迅速上调。利用免疫印迹进一步验证了脂多糖免疫24 h时后L-Tgfbr1在白细胞中的蛋白表达水平显著上调。利用免疫荧光染色发现L-Tgfbr1蛋白主要分布于七鳃鳗白细胞和髓小体细胞的细胞质中。以上结果表明L-Tgfbr1及其介导的TGF-β通路可能在七鳃鳗免疫调控中发挥重要功能。

日本七鳃鳗生活史标本的制作

七鳃鳗系圆口纲无颌类脊椎动物,是脊椎动物中古老的类群,在生物进化和发育中具有重要地位。日本七鳃鳗生活史标本制作以日本七鳃鳗卵、胚胎、卵黄囊期仔鳗、幼体、亚成体和成体为实验材料,采用浸制和剥制两种方式制作标本,经过选取—麻醉—测量—固定—剥皮—填充—缝合—整形等工艺流程,制作日本七鳃鳗卵、幼体、亚成体和成体标本,布置胚胎发育,幼鳗穴居滤食、亚成体寄生生活、性成熟个体的生殖洄游、筑巢、交配和产卵直至产后死亡的生活场景,并结合图片、文字,展示其不同发育阶段的形态特征和生态习性,生动、完整地展现了七鳃鳗的生活史,对七鳃鳗的教学、科研和科普具有重要意义。

东北七鳃鳗和日本七鳃鳗成体形态性状对体质量的影响分析

为研究东北七鳃鳗和日本七鳃鳗形态性状对体质量的影响,测量314尾东北七鳃鳗和302尾日本七鳃鳗成体的体质量(Y)和全长(X_1)、躯干长(X_2)、尾长(X_3)、头长(X_4)、吻长(X_5)、眼径(X_6)、背鳍前长(X_7)、眼后头长(X_8)8个形态性状,运用相关分析、通径分析和回归分析方法,确定影响体质量的主要形态性状,建立体质量和形态性状的多元回归方程。分析结果显示:东北七鳃鳗和日本七鳃鳗体质量服从正态分布,体质量的变异系数最大,全长、躯干长、尾长、头长、吻长、眼径、背鳍前长和眼后头长8个形态性状均与体质量呈正相关(P<0.01)。经偏回归系数检验,东北七鳃鳗全长、头长、眼径和眼后头长呈显著性水平(P<0.05),其通径系数分别为0.636、0.202、0.060和0.105;日本七鳃鳗全长、吻长和眼后头长呈极显著性水平(P<0.01),其通径系数分别为0.730、0.098和0.153。单个性状对体质量的决定系数中,东北七鳃鳗和日本七鳃鳗全长对体质量的决定系数最大。东北七鳃鳗和日本七鳃鳗形态性状的单独决定系数和两个共同决定系数的总和分别为0.855和0.857。建立以东北七鳃鳗全长、头长、眼径和眼后头长4个形态性状为自变量,体质量为因变量的多元回归方程:Y=1.502X_1+2.699X_4+8.554X_6+1.915X_8-41.547;日本七鳃鳗全长、吻长和眼后头长3个形态性状为自变量,体质量为因变量的多元回归方程:Y=4.895X_1+9.688X_5+6.973 X_8-157.460。东北七鳃鳗和日本七鳃鳗成体形态性状对体质量的分析为七鳃鳗优良亲本的人工选育以及其形态学研究提供参考依据。

溪七鳃鳗肌肉细胞膜胰岛素受体的研究

溪七鳃鳗肌肉细胞膜胰岛素受体的研究张新堂，徐明华，王楠，朱尚权（中国科学院上海生物化学研究所，上海２０００３１）郭春生（哈尔滨师范大学生化学研究所，哈尔滨１５００８０）七鳃鳗是现存的最原始的圆口类无颌脊推动物之一，它的形态学和生理学特性已有详细研究和...

瑞氏七鳃鳗乳酸脱氢酶（LDH）同工酶凝胶电泳分析

本文用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对瑞氏七鳃鳗五种不同组织（骨骼肌、心、肾、肠、鳃）中ＬＤＨ同工酶进行了分析研究，结果表明，ＬＤＨ同工酶具有组织特异性，其中骨骼肌中含有五种ＬＤＨ同。酶，即ＬＤＨ１、ＬＤＨ２、ＬＤＨ３、ＬＤＨ４、ＬＤＨ５，鳃含有ＬＤＨ１和ＬＤＨ４而肾和心只含有ＬＤＨ１，肠只含有ＬＤＨ４。

日本七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺表达序列标签(EST)分析

以日本七鳃鳗口腔腺为材料,构建库容量为2.1×106pfu/mL的cDNA文库。通过对文库中克隆子的序列测定和生物信息学初步分析,得到1323条有效EST序列。经BlastX及BlastN软件进行同源对比分析,653条(49.36%)EST可在蛋白质或核苷酸水平上找到同源序列,其中328条与七鳃鳗科物种同源。同源序列功能分类大致分为11类,与蛋白质合成有关的蛋白所占比例最大。1323条EST进行片段重叠群分析(contig analysis)获得包括547条序列在内的162组片段重叠群并确定了8条全长cDNA。日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库以及EST文库的成功构建,为研究日本七鳃鳗口腔腺的功能基因和蛋白质组学奠定了基础。

七鳃鳗血清中补体C3和VLRB介导的免疫防御

日本七鳃鳗(Lampetra japonica)属最原始的无颌类脊椎动物,是研究免疫起源与进化的重要模式生物。七鳃鳗血清中C3分子(L-C3)是其含量最高的补体成分,在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用。本文通过PCR扩增获取C3分子α-γ链的基因序列,构建到原核表达载体p ET-28a,成功在大肠杆菌中表达C3部分蛋白质并制备多克隆抗体。利用流式细胞术和激光共聚焦证明,L-C3分布在神经轴体的胞浆中。免疫共沉淀及细胞沉积结果显示,七鳃鳗血清中,VLRB与L-C3蛋白相互作用并共沉积于靶细胞膜表面。天然L-C3和VLRB清除实验,验证其在参与七鳃鳗血清杀伤靶细胞时发挥重要作用。本研究为七鳃鳗补体系统的研究奠定了基础,为七鳃鳗免疫起源与进化提供重要资料。

日本七鳃鳗(Lampetrs japonica)唾液腺cDNA文库的构建

以水生动物日本七鳃鳗唾液腺为材料,应用Gubler和Hoffman技术方法,构建以pBluescriptⅡSK(+)载体为基础的日本七鳃鳗唾液腺cDNA筛选文库.通过对文库的鉴定,文库的库容量为1.5×106转化子/μgcDNA,插入片段的平均长度为1.0kb.该文库保留了日本七鳃鳗唾液腺中蛋白质的分子信息,为进一步研究其组分和作用机理奠定了基础.

日本七鳃鳗类淋巴细胞的分离及细胞学特征

为分离纯化并鉴定日本七鳃鳗(Lampetra japonica)血液中的类淋巴细胞,采用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞层,并得到分离单个核细胞层的最佳分离液比重为1.092。利用流式细胞仪对分离到的单个核细胞层细胞进行分选,根据细胞的前向光及侧向光散射特征成功分选出类淋巴细胞,分选效率为95.68%,每毫升外周血可分离纯化得到类淋巴细胞2.4×106个。通过透射电镜观察七鳃鳗类淋巴细胞,细胞为圆形或椭圆形,细胞表面有突起、无微绒毛,胞质内含有板状嵴线粒体、粗面内质网、游离核糖体和液泡等。淋巴细胞异质性实验结果表明,日本七鳃鳗血液白细胞中尚未发现T淋巴细胞、B淋巴细胞的分化。

七鳃鳗鳃黏膜免疫系统类淋巴细胞免疫应答遗传基础

近年来,在无颌类脊椎动物七鳃鳗体内发现了以可变淋巴细胞受体(Variable lymphocyte receptors,VLR)为基础的抗原识别机制。为揭示七鳃鳗鳃黏膜免疫系统中类淋巴细胞适应性免疫应答的遗传基础,探索无颌类与有颌类脊椎动物在适应性免疫应答机制上的进化关系,本文构建了日本七鳃鳗(Lampetra japonica)鳃囊组织免疫前后c DNA文库并进行了高通量转录组测序及分析。通过对组装得到的88 525个独立基因(Unigene)进行功能注释,分别有21 704和9769个unigene在GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库得到注释。999个unigene参与免疫系统的多个通路,其中184个与高等脊椎动物TCR(T cell receptor)和BCR(B cell receptor)信号通路的51个分子具有较高的同源关系,说明七鳃鳗体内存在高等脊椎动物适应性免疫应答信号通路的相关分子。本文还发现5个VLRA、7个VLRB和4个VLRC分子,说明七鳃鳗鳃黏膜免疫组织内至少分布3种类淋巴细胞亚群。实时荧光定量PCR结果显示,Lck、Fyn和Zap70基因在免疫激发后表达量显著上调,而Syk、Btk和Blnk基因表达没有显著变化,说明七鳃鳗鳃组织受到抗原刺激后,类似T淋巴细胞的信号转导途径被激活。本研究初步证明,尽管无颌类和有颌类脊椎动物的适应性免疫系统在抗原识别机制上存在不同,但具有共同的遗传基础。研究结果为探讨七鳃鳗VLRA+、VLRB+和VLRC+淋巴细胞免疫应答信号传导过程提供了有价值的线索。

日本七鳃鳗胚胎发育及卵黄囊期仔鱼的异速生长

通过观察日本七鳃鳗Lampetra japonica(Martens,1868)胚胎外部形态和内部组织结构变化,描述受精卵从卵裂至器官形成以及仔鱼孵出的发育阶段,采用实验生态学方法研究卵黄囊期仔鱼的异速生长模式。结果表明:日本七鳃鳗卵子为乳白色,呈卵圆形;受精卵卵裂方式为全卵裂;胚胎发育过程主要包括卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、头凸期、孵出前期和孵出期,历时11—12d;初孵仔鱼为乳白色,全长约(3.41±0.24)mm,体质量约为0.0006 g。日本七鳃鳗胚胎发育研究可为了解七鳃鳗胚胎发育过程,早期脊椎动物的起源和发育进化研究提供参考。卵黄囊期内仔鱼身体各部分中,头长和尾长均表现出快速生长,同在7日龄出现生长拐点,且生长拐点后的生长速率都大于生长拐点前的生长速率;而仔鱼体长在卵黄囊期内表现出慢速生长。在头部器官中,吻长、鳃前长和鳃长均表现出快速生长现象,吻长和鳃长分别在9日龄和8日龄出现生长拐点;口笠长在3日龄时出现生长拐点,在生长拐点前为等速生长,而在生长拐点后表现出快速生长;眼径和眼鳃间距则分别表现出等速生长和慢速生长。泄殖孔在卵黄囊期内未出现生长拐点,生长速率相对于全长生长速率表现出快速生长现象。七鳃鳗卵黄囊期仔鱼的异速生长是在长期进化过程中,适应早期生活环境和独特的生活方式而形成特有的发育机制。

七鳃鳗遗传多样性与演化研究进展

七鳃鳗(Petromyzonidae)是目前已知最古老的脊椎动物中惟一的幸存者。对其资源保护和演化发育生物学的研究正日益受到重视。本文从染色体、蛋白质和DNA水平总结近年来七鳃鳗遗传多样性与演化方面的研究进展。重点介绍了限制性酶切片段长度多态性、DNA随机扩增多态性、DNA扩增片段长度多态性、微卫星DNA标记等技术及线粒体DNA和功能基因研究应用于七鳃鳗种群遗传多样性、遗传分化、遗传结构、种质鉴定与渔业资源管理及系统进化等方面的新进展。

日本七鳃鳗富含半胱氨酸RGD蛋白Lj-RGD1抑制血小板聚集及抗血管新生功能

Lj-RGD1来源于日本七鳃鳗口腔腺,富含半胱氨酸并具有RGD(Arg-Gly-Asp)模体.为了验证Lj-RGD1是否具有抑制血小板聚集、抗血管新生等去整合素样典型功能,本文对七鳃鳗Lj-RGD1进行了克隆表达及活性测定.提取七鳃鳗口腔腺中总RNA进行RT-PCR扩增,获得Lj-RGD1的420bp cDNA.对其进行克隆、表达及组氨酸亲和层析纯化后,获得分子量为16.9 kD的可溶性蛋白rLj-RGD1.活性测定结果显示,rLj-RGD1呈剂量依赖方式抑制ADP诱导的兔血小板聚集,IC50为12.3μmol/L;血管新生抑制实验结果表明,rLj-RGD1能够诱导ECV304细胞凋亡,抑制ECV304细胞增殖和管状物形成,并呈剂量依赖性方式抑制鸡胚胎绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)血管新生.由此可见,Lj-RGD1具有去整合素样生物活性,在血栓或血管异常新生类疾病治疗中具有应用前景.

日本七鳃鳗RGD毒素肽Lj-RGD2的克隆、表达及其抗血管新生活性

日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白Lj-RGD2毒素肽分子质量为8 kD,是含有2个RGD(Arg-Gly-Asp)模体序列的多肽.为了探讨其是否具有RGD毒素蛋白的功能,对其基因进行了克隆和表达,并对其重组蛋白进行了抗血管新生活性研究.从日本七鳃鳗口腔腺中提取mRNA,以自行设计的引物进行RT-PCR扩增,以获得Lj-RGD2基因;将获取的目的基因与pET23b载体连接,经转化、克隆、阳性转化子的筛选鉴定;将含组氨酸标签的pET23b-Lj-RGD2转化BL21菌中诱导表达;经亲和层析纯化,获得可溶性重组rLj-RGD2蛋白,并对重组rLj-RGD2蛋白的抗血管新生功能进行了研究.结果显示,rLj-RGD2蛋白的IC50为1.77μmol/L,并以剂量依赖方式抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖;rLj-RGD2蛋白还能抑制ECV304细胞对人工基质膜Matrigel的黏附、以BFGF(basicfibroblast growth factor)为趋化剂的迁移及侵袭.鸡胚绒毛尿囊膜CAM(chick chorioallantoic membrane)血管新生实验结果表明,rLj-RGD2蛋白能以剂量依赖方式抑制BFGF诱导的CAM血管新生.由此可见,rLj-RGD2蛋白具有RGD毒素肽的活性特征,其有望成为一种抗血管新生基因工程新药.

日本七鳃鳗(Lampetra japonica)Lyb基因的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE技术,从日本七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺、肝脏中分离获得了3条Y-box基因序列,分别命名为Lyb1、Lyb2和Lyb3,生物信息学分析其编码的蛋白质序列长度分别为331、181和171个氨基酸残基。采用DNAMAN软件,将七鳃鳗的3个Y-box蛋白氨基酸序列蛋蛋蛋、蛋马蛋、蛋蛋、蛋蛋蛋和小鼠Y-box蛋白进行同源性分析,结果显示他们共有一个保守的冷休克结构域,其中包含两个RNA结合基序RNP-1和RNP-2,表明获得的Lyb基因属于Y-box基因家族成员。此外,从Swiss-Prot下载了经实验验证过的Y-box蛋白序列数据,结合实验克隆得到的Lyb基因所编码的氨基酸序列构建系统发育树,发现Y-box基因在有颌类出现以前只有一种类型,有颌类出现以后,Y-box基因分化成YB1、YB2和CSDA三种类型。

七鳃鳗CD63的分子克隆、生物学特性及表达分析

从日本七鳃鳗和东北七鳃鳗中克隆得到了CD63基因的ORF区,预测了其编码的氨基酸序列.利用生物信息学方法进行了氨基酸序列分析并构建了进化树.实时定量PCR技术分析表明:CD63在日本七鳃鳗的心脏、肝脏、肌肉、髓、鳃、肠和卵中均有表达.其中,在卵中的表达量最高.脂多糖(LPS)体内刺激日本七鳃鳗后发现,CD63在肝脏和肌肉中的表达显著升高.本研究为进一步了解CD63分子在七鳃鳗的免疫方面的作用提供了实验依据.