多穗柯三叶苷的抑制糖尿病关键酶活性和抗氧化性

从多穗柯中提取分离得到三叶苷,以抗糖尿病药物阿卡波糖为阳性对照,检测多穗柯三叶苷对小肠α-葡萄糖苷酶和胰脏α-淀粉酶活性的抑制作用和对α-葡萄糖苷酶活性抑制类型,并以芦丁为阳性对照检测其清除DPPH自由基能力。结果显示:多穗柯三叶苷对α-葡萄糖苷酶有明显抑制作用,为非竞争性抑制,抑制效果与阿卡波糖无明显差别,对α-淀粉酶活性的抑制率低于阿卡波糖;清除DPPH自由基能力强于芦丁。表明多穗柯三叶苷是一种有应用潜力的抗糖尿病活性物质。

三叶苷对下肢缺血再灌注小鼠肾损伤的保护作用

目的探讨三叶苷(trilobatin,TLB)减轻下肢缺血再灌注(lower-limb ischemia reperfusion,LIR)所致的肾损伤及其机制。方法制备LIR模型,将C57BL6小鼠随机分为4组:对照组(不进行LIR模型制备)、损伤组(建立LIR模型)、预处理组(预先给予TLB,再建立LIR模型)、抑制剂组(预先给予SIRT3选择性抑制剂,再给予TLB,之后建立LIR模型)。LIR后,抽取外周血并分离肾组织,HE染色观察肾组织病理学改变及损伤评分,生化分析仪检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平,DHE染色检测肾组织中活性氧(ROS)水平,相应试剂盒检测外周血丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量,Western blot检测肾组织中沉默信息调节因子3(SIRT3)/超氧化物歧化酶2(SOD2)信号通路的蛋白表达情况。结果与对照组相比,损伤组肾组织病理学损伤评分增高,外周血中Scr、BUN和肾组织中ROS、MDA升高,肾组织中SOD降低,SIRT3、SOD2表达水平下调(P均<0.05);与损伤组比较,预处理组肾组织病理学损伤评分、Scr、BUN、ROS、MDA降低,SOD升高,SIRT3、SOD2表达水平上调(P均<0.05);与预处理组比较,抑制剂组肾组织病理学损伤评分、Scr、BUN、ROS、MDA升高,SOD下降,SIRT3、SOD2表达水平下调(P均<0.05)。结论三叶苷预处理可减轻下肢缺血再灌注的氧化应激反应,改善肾损伤,其机制可能与激活SIRT3/SOD2通路有关。

SIRT3/FoxO3a通路参与三叶苷预处理保护下肢缺血再灌注继发的肺损伤

目的基于SIRT3/FoxO3a通路探讨三叶苷(TLB)预处理能否减轻下肢缺血再灌注(IR)继发的肺损伤及其具体机制。方法制备下肢IR模型,50只小鼠随机分为5组,即假模型组(Control组)、缺血再灌注组(IR组)、三叶苷组(TLB+IR组)、三叶苷+SIRT3抑制剂组(3-TYP+TLB+IR组)、SIRT3抑制剂组(3-TYP+IR组)。模型建立后,抽取动脉血进行血气分析,观察肺组织病理学改变及凋亡情况,测定氧化应激指标中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量,以及肺组织中沉默信息调节因子3(SIRT3)、叉头框蛋白O3a(FoxO3a)蛋白表达水平。结果与Control组相比,IR组血气指标明显下降,光镜下可见肺泡形态结构破坏并伴大量炎性细胞浸润,肺组织中SOD、GSH-Px活力显著下降、MDA含量和凋亡水平明显增高(P<0.05)。TLB+IR组因三叶苷干预后,可有效改善血气指标,光镜下可见肺泡形态结构相对完整,肺损伤评分相对降低,肺组织氧化应激损伤和凋亡水平相对减轻,SIRT3/FoxO3a信号通路激活(P<0.05)。3-TYP+TLB+IR组应用SIRT3特异性抑制剂(3-TYP)抑制SIRT3信号通路后,三叶苷的保护作用明显减弱(P<0.05)。而3-TYP+TLB+IR组与3-TYP+IR组指标差异无统计学意义。结论三叶苷预处理可减轻氧化应激反应,改善下肢缺血再灌注继发的肺损伤,其机制可能与调节SIRT3/FoxO3a通路有关。

多穗柯三叶苷对脂多糖诱导小鼠炎症反应的保护作用

探讨多穗柯三叶苷对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠炎症反应的抗炎症作用。以3、30、300 mg/(kg·d)3个剂量组的多穗柯三叶苷灌胃小鼠3 d后,腹腔注射0.1 mg/kg LPS,观察三叶苷预处理对LPS诱导的炎症因子表达的影响。酶联免疫反应测定小鼠血清中炎症因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的含量,实时定量聚合酶链式反应法检测肝组织中TNF-α和IL-6的m RNA水平,免疫组织化学染色检测小鼠肝组织中TNF-α和IL-6蛋白水平。结果表明,3 mg/(kg·d)三叶苷剂量组可显著抑制LPS诱导的小鼠血清中TNF-α和IL-6的分泌,降低肝组织中TNF-α和IL-6的表达水平。多穗柯三叶苷对小鼠的炎症反应具有一定的保护作用。

木姜叶柯中根皮苷与三叶苷含量测定研究

目的测定15份木姜叶柯样品中根皮苷与三叶苷的含量并比较其差异。方法采用高效液相色谱(HPLC)法,色谱柱为Phenomenex Gemini C_(18)柱(250 mm×4.6 mm,5μm),检测波长为280 nm,流动相为乙腈-水(0.1%的磷酸),梯度洗脱,流速为1.0 m L/min。结果根皮苷进样量在0.250～5.000μg范围内与峰面积相关性较好,回归方程为C=0.000 603 A-0.021,r=0.999 8(n=7);三叶苷进样量在0.575～5.750μg范围内与峰面积相关性较好,回归方程为C=0.000 470 A-0.041,r=0.999 6(n=7)。15份木姜叶柯样品中根皮苷含量为0.62%～9.04%,三叶苷含量为0.30%～22.79%。结论该方法简便,结果准确可靠,可用于测定木姜叶柯中根皮苷与三叶苷含量。

三叶苷对N-甲基-D-天冬氨酸诱导的人神经母细胞瘤细胞损伤的保护作用

目的研究三叶苷(Trilobatin)对N?甲基?D?天冬氨酸(N?methyL?D?aspartate,NMDA)诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH?SY5Y)损伤的保护作用。方法采用体外细胞培养的方法,建立SH?SY5Y细胞NMDA损伤模型。分设对照组(0 mmol/L NMDA)、NMDA损伤模型(0μmol/L三叶苷)组、三叶苷组(10,50,100μmol/L)。对照组正常培养,NMDA损伤模型组以2 mmol/L的NMDA为造模浓度,三叶苷组在NMDA损伤模型组的基础上分别以10,50,100μmol/L的三叶苷为细胞活性测试浓度。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测定三叶苷对SH?SY5Y细胞活性的影响;通过MTT法、乳酸脱氢酶(LDH)释放量检测三叶苷对NMDA诱导SH?SY5Y细胞损伤的保护作用,用蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞内促凋亡蛋白Bax,抗凋亡蛋白Bcl?2及NMDA受体调节亚单位NR2B蛋白表达水平,研究其作用机制。结果三叶苷在1~100 mmoL/L范围内不影响SH?SY5Y细胞的存活率。与对照组相比,NMDA损伤模型组细胞存活率为(53.13±3.31)%,细胞存活率明显降低,细胞凋亡明显增高。与对照组相比,三叶苷组(10,50,100μmol/L)细胞存活率分别为(56.28±2.05)%、(68.64±1.74)%及(75.98±1.84)%,细胞存活率明显增高(F=293.3,P<0.001),LDH释放量减少,细胞凋亡明显降低(F=314.1,P<0.001)。三叶苷参与调控NR2B亚单位及凋亡相关蛋白的表达,可降低NR2B蛋白与促凋亡蛋白Bax的表达,上调抗凋亡蛋白Bcl?2的表达。结论三叶苷对NMDA诱导的神经母细胞瘤SH?SY5Y细胞损伤有保护作用,其作用机制与NR2B亚单位相关。

正交试验优选木姜叶柯中三叶苷提取工艺

目的采用正交试验法优化木姜叶柯中三叶苷的提取工艺。方法以三叶苷含量为评价指标,以液料比、提取时间、提取次数为影响因素,采用L9(34)正交试验,优选木姜叶柯中三叶苷提取工艺。结果对木姜叶柯中三叶苷含量的影响强度依次为提取次数>提取时间>液料比;优选出的最佳提取工艺为液料比15∶1,提取3次,每次1. 5 h;经试验验证,平均含量为33. 89%,RSD为1. 14(n=3)。结论所优选的提取工艺稳定可靠,流程简单,提取率高,可为大规模生产提供参考。

新型功能甜味剂——三叶苷

三叶苷由于其独特的生物活性及风味特性,成为近年国际上一种新兴的功能型甜味剂,在食品领域有着广泛的应用。对三叶苷的植物来源、理化性质、分离纯化方法、检测方法及生物活性进行了综述,重点叙述了三叶苷的检测方法及生物活性,旨在为三叶苷的合理有效开发利用,提供参考依据。三叶苷具有多植物基源,在我国主要分布于木姜叶柯叶片之中,但各地样品叶片中三叶苷含量具有显著的差异,提示对此植物资源的品种与采收期仍需进行更深入的研究。木姜叶柯是一种速生乔木,在我国各地均有分布,植物资源蕴藏量大,可为三叶苷提供充足的原料基础。三叶苷具有降血糖、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用,甜味口感良好,有望成为继甜菊糖苷、罗汉果甜苷之后,又一天然高倍甜味剂。

超高效液相色谱-串联质谱法测定不同pH值溶液中三叶苷平衡溶解度和表观油水分配系数

目的建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法测定三叶苷含量,考察三叶苷在不同pH值缓冲液中平衡溶解度和表观油水分配系数。方法选用Kinetex XB-C18柱(100 mm×2.1 mm,2.6μm),流动相为0.1%甲酸溶液(A)/乙腈(B),采用梯度洗脱:起始B为10%并持续1.00 min;1.00~8.00 min B变为80%,并持续至12.00 min;12.01 min B变为10%并持续至15.00 min。采用摇瓶法考察三叶苷在不同pH值缓冲液中平衡溶解度及其在正辛醇-磷酸盐缓冲液中表观油水分配系数。结果三叶苷在pH值1.2,2.0,4.5,6.5,7.5,9.0,10.5,12.0缓冲液中平衡溶解度分别为0.90,1.16,1.83,2.72,3.91,11.73,15.51,23.79 mg·mL^(-1)。在pH值1.2~12.0范围内,三叶苷油水分配系数lgP值分布在-0.58~0.26。结论三叶苷为难溶性药物,其平衡溶解度和表观油水分配系数均受溶液pH值的影响,溶解度随着溶液pH值升高而明显增大,而表观油水分配系数则显著下降。

三叶苷调控miR-539-5p表达保护缺氧缺糖心肌细胞损伤研究

目的:探讨三叶苷对缺氧缺糖心肌细胞损伤的保护作用及机制。方法:采用不同浓度的三叶苷作用于缺氧缺糖诱导的心肌细胞H9C2,试剂盒检测丙二醛(MDA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,流式细胞术、蛋白质印记(Western blot)检测细胞凋亡以及B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl相关X蛋白(Bax)蛋白表达,实时荧光定量PCR(RTq PCR)检测miR-539-5p表达。转染miR-539-5p模拟物至H9C2细胞,检测过表达miR-539-5p对缺氧缺糖诱导的H9C2细胞损伤的影响。结果:三叶苷作用于缺氧缺糖诱导的H9C2细胞后,细胞中MDA含量、LDH释放量、细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平显著降低,SOD活性、Bcl-2蛋白和miR-539-5p表达水平显著升高(P<0.05)。过表达miR-539-5p后,缺氧缺糖诱导的H9C2细胞中MDA含量、LDH释放量、细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平显著降低,SOD活性、Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。抑制miR-539-5p表达可减弱三叶苷对缺氧缺糖诱导的H9C2细胞MDA含量、LDH释放量、SOD活性、凋亡,以及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。结论:三叶苷可有效降低缺氧缺糖诱导的心肌细胞损伤,其机制与上调miR-539-5p表达有关。

三叶苷质量标准初步研究

目的初步研究三叶苷的质量标准。方法取木姜叶柯药材,采用热水提取及乙醇热饱和结晶制得三叶苷纯品,测定三叶苷纯品的水分,并利用碳谱、氢谱及薄层色谱鉴定其真伪。结果经上述波谱及薄层色谱鉴定,水分平均值为3. 55%,其结构为三叶苷。结论该方法可用于三叶苷质量标准的初步研究。

高效液相色谱法测定木姜叶柯中根皮苷、三叶苷和根皮素的含量

建立高效液相色谱法同时测定木姜叶柯中三叶苷、根皮苷和根皮素的含量。采用C18色谱柱;检测波长285nm,流动相为乙腈-0.04%甲酸,梯度洗脱;流速0.8mL/min;柱温40℃。三叶苷、根皮苷和根皮素的加标回收率分别为102.54%、102.01%和102.12%,RSD分别为1.66%、2.21%和2.38%。该方法适用于木姜叶柯中根皮苷、三叶苷和根皮素的含量分析,为其药材质量的判定提供数据参考。

三叶苷对人正常肝细胞L-02增殖作用的研究

目的探究三叶苷(TLB)促进人正常肝细胞L-02的增殖作用。方法人正常肝细胞L-02经不同浓度的TLB处理后,通过MTT法测定TLB对L-02细胞活力的影响,采用BrdU ELISA法和EDU荧光染色法分别观察L-02细胞DNA的含量和细胞增殖的改变,通过免疫印迹法分析细胞周期相关调节蛋白的表达。结果TLB(25、50、100μM)作用L-02细胞72 h能够明显增加L-02的细胞活力,并明显增加BrdU含量及EDU的荧光强度,同时TLB能够明显下调L-02细胞中HNF4α的蛋白表达,上调CDK4、cyclin D1、HGF的蛋白表达,并增加c-Met的磷酸化水平和其下游Akt、Erk1/2的磷酸化水平。结论TLB对人正常肝细胞L-02具有促增殖作用,其机制可能与调控HGF/c-Met信号途径有关。

甜茶木姜叶柯及其主要活性成分三叶苷药理作用研究进展

木姜叶柯Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun.又名多穗石柯Lithocarpus polystachyus Rehd.,俗称甜茶,属于药食同源中药,集药、茶、食、糖多种用途于一体。木姜叶柯富含三叶苷、根皮苷、根皮素等二氢查尔酮类成分。本文综述了木姜叶柯及其主要成分三叶苷在调节糖脂代谢、抗炎、抗衰老与抗氧化应激、神经保护和保肝等药理作用方面的国内外研究进展,以期为甜茶木姜叶柯的后续研究与综合开发利用提供依据。

催化根皮素生成三叶苷的来源于穿心莲的糖基转移酶UGT74L2及其酶学研究

根皮素-4’-O糖基转移酶(P4’-OGT)是三叶苷生物合成途径中最后一步关键酶,可在体外催化根皮素生成三叶苷,但目前仅有少数P4’-OGT被鉴定。本研究利用已报道的苹果中P4’-OGT(MdPh-4’-OGT)序列对穿心莲转录组进行筛选,获得两条同源基因UGT74L2和UGT74L3。系统发育树分析表明,UGT74L2和UGT74L3与其他物种中已鉴定功能的UGT74家族聚为一类。体外酶促反应显示,UGT74L2可特异性催化根皮素生成三叶苷,而UGT74L3无产物产生。通过Ni-NTA亲和色谱纯化获得可溶性UGT74L2重组蛋白,以根皮素为底物进行酶促动力学研究。研究结果表明,UGT74L2酶促反应最适温度为40℃,最适pH值为8.0(Tris-HCl体系)。Ca^(2+)、Mn^(2+)、Co^(2+)对UGT74L2的活性有一定的抑制作用,而Mg^(2+)可提高UGT74L2的活性,其他金属离子对UGT74L2活性无明显影响。酶促动力学参数测定结果显示,K_(m)值为29.84μmol·L^(-1),kcat值为0.02 s^(-1),k_(cat)·K_(m)^(-1)值为572.6 mol^(-1)·s_(-1)。同源建模、分子对接结合突变实验结果显示,底物结合口袋中的多个氨基酸与其催化活性密切相关。本研究从穿心莲中鉴定了一条新的P4’-OGT,可为活性天然产物三叶苷的生物合成提供糖基化元件,也可为其他植物糖基转移酶的功能挖掘提供参考。

RhoA/ROCK2信号通路在三叶苷减轻大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用

目的:评价Rho亚家族蛋白A(RhoA)/Rho相关的卷曲连接蛋白激酶2(ROCK2)信号通路在三叶苷减轻大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。方法:清洁级健康雄性SD大鼠80只,6~8周龄,体重230~280 g,采用随机数字表法分为4组(n=20):假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(IR组)、脑缺血再灌注+三叶苷组(T组)和脑缺血再灌注+三叶苷+RhoA/ROCK2信号通路激动剂AA组(A组)。采用大脑中动脉栓塞法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。T组和A组大鼠于缺血前3 d给予三叶苷15 mg/kg灌胃,2次/d,连续3 d,A组大鼠于每次灌胃前腹腔注射RhoA/ROCK2信号通路激动剂AA 10 mg/kg。于再灌注24 h时行神经行为学评分,随后处死大鼠取海马组织,采用流式细胞术检测海马神经元凋亡率,TTC染色确定脑梗死体积,采用Western blot法检测磷酸化RhoA(p-RhoA)、ROCK2和裂解的caspase-3(cleaved caspase-3)的表达,透射电镜下观察海马神经元超微结构。结果:与S组比较,IR组大鼠神经行为学评分和海马神经元凋亡率升高,脑梗死体积增加,p-RhoA、ROCK2和cleaved caspase-3表达上调(P<0.05),海马神经元病理学损伤加重;与IR组比较,T组大鼠神经行为学评分和海马神经元凋亡率降低,脑梗死体积减少,p-RhoA、ROCK2和cleaved caspase-3表达下调(P<0.05),海马神经元病理学损伤减轻;与T组比较,A组大鼠神经行为学评分和海马神经元凋亡率升高,脑梗死体积增加,p-RhoA、ROCK2和cleaved caspase-3表达上调(P<0.05),海马神经元病理学损伤加重。结论:RhoA/ROCK2信号通路参与了三叶苷减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的过程,可能与抑制海马神经元凋亡有关。

HPLC法测定苦参中三叶豆紫檀苷的含量

目的:建立HPLC法测定苦参中三叶豆紫檀苷的含量。方法:以SUPELCO C_(18)(25 cm×4.6 mm,5 μm)为分析柱,甲醇-水(1:1)为流动相,流速为1.0 mL·min^(-1),检测波长为310 nm,采用外标法定量测定。结果:三叶豆紫檀苷进样量在0.41—4.10μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9998)。平均回收率为98.72%,99.20%,99.47%;RSD为1.1%,1.5%,2.2%(n=3)。结论:本方法操作简便,结果准确可靠,适用于苦参中三叶豆紫檀苷含量的测定。

HPLC测定消银片中三叶豆紫檀苷的含量

目的:测定消银片(地黄,苦参,金银花等)中三叶豆紫檀苷的含量.方法:HPLC法,色谱柱为HiQ sil C18(25 cm×4.6 mm,10μm),流动相为甲醇-水(6:5.5,V/V),流速为1.0 mL·min-1,检测波长为310 nm.结果:三叶豆紫檀苷进样量在0.41～4.10 μg范围内呈良好的线性关系,平均回收率为99.95%,RSD为2.40%.结论:本方法简便,准确,重现性好,可作为消银片中三叶豆紫檀苷的含量测定方法.

红车轴草中(6aR,11aR)-三叶豆紫檀苷对马铃薯腐烂茎线虫的麻醉活性研究

从红车轴草(Trifolium pratense L.)根乙醇提取物中分离得到了黄酮苷类化合物(6aR,11aR)-三叶豆紫檀苷,并运用核磁共振波谱学技术鉴定了其化学结构。采用实验室活体生物试验方法,研究了(6aR,11aR)-三叶豆紫檀苷对马铃薯腐烂茎线虫的麻醉活性。结果表明,该化合物对马铃薯腐烂茎线虫二龄幼虫有一定的麻醉活性,麻醉作用的强度与其浓度及作用时间密切相关。

RP-HPLC法测定山豆根中三叶豆紫檀苷的含量

目的:建立RP-HPLC测定山豆根中三叶豆紫檀苷含量的方法。方法:色谱柱为Symmetry shield RP C18柱,流动相为甲醇-水(50:50),检测波长为310nm。结果:三叶豆紫檀苷在0.49～4.9μg范围内与峰面积有良好的线性关系;精密度试验相对标准偏差为1.31%;加样回收率为96.69%～98.57%;山豆根中三叶豆紫檀苷含量为0.019%。结论:本法操作简便,结果准确,可用于山豆根中三叶豆紫檀苷含量的测定。