梨火疫病病原菌(Erwinia amylovora)三型分泌系统的鉴别及Erwinia spp. HrpA的分析

【目的】明确梨火疫病病原菌(Erwinia amylovora)三型分泌系统(type Ⅲ secretion system,TTSS)的所在区域、相关基因及Erwinia spp.的HrpA(hypersensitive response and pathogenicity gene A)选择压水平。【方法】利用生物信息学方法,通过BLAST程序对梨火疫病菌基因组的核苷酸数据库进行同源比对,同时对Erwinia spp.与宿主互作的表面蛋白HrpA进行选择压分析。【结果】TTSS分析结果显示在40kb大小的毒力岛上有27个TTSS相关基因。通过与看家基因及毒力岛上的致病性相关的重要基因HrpN的比较、选择压分析、多序列比较,发现HrpA基因处于较强的选择压作用下,且HrpA蛋白N端主要受正向选择,C端主要受净化选择。NJ法构建的HrpA系统发育树显示Erwinia spp.形成两个明显的分支,表明HrpA基因可能在种间分化后产生了不同的选择压变化。【结论】梨火疫病病原菌基因组3.14-3.18Mb为其TTSS分布区域。该病原菌通过TTSS侵染寄主植物,在其病原菌表面有一种类鞭毛结构的TTSS蛋白HrpA,HrpA作为传输者起着将效应分子输送到宿主内部的功能,在进化上受到了较强的选择压影响。

牛源性肠炎沙门氏菌的三型分泌系统基因分析

肠炎沙门氏菌是一类引起人与动物腹泻的病原菌,其致病性与三型分泌系统密切有关。本次试验研究临床上腹泻牛体内分离的一株肠炎沙门氏菌致病性与三型分泌系统的关系,试验选取SipA、SipD的基因序列进行测序分析。本次试验分别运用特异性引物扩增SipA、SipD的基因,连接到T载体上并测定目的片段序列。测出的序列在GeneBank上进行比对,以确定分离菌与其他菌株亲缘关系。试验结果显示该株肠炎沙门氏菌的SipA基因、SipD基因与肠炎沙门氏菌P125109同源性达100%。

三型分泌系统效应蛋白调控细胞凋亡和焦亡的研究进展

病原菌感染对人类健康构成了严重的威胁,一类具有三型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)的致病菌,可以通过T3SS将效应蛋白"注射"到宿主细胞中,去干扰宿主细胞的多种信号转导通路,从而促进病原菌的增殖和传播。T3SS效应蛋白对宿主的影响被广泛研究,并且不同病原菌采取相似或不同的策略,同一种病原菌的效应蛋白又具有协同或拮抗的功能。综述了T3SS效应蛋白参与宿主细胞凋亡和焦亡信号通路过程中所发挥的功能及分子机制的最新研究进展,并进行了归纳分析,旨在为T3SS效应蛋白的深入研究提供参考和思路,从而进一步推进病原菌致病机制的研究,为防治病原菌提供理论基础。

鸡白痢沙门菌中三型分泌系统-2效应蛋白基因分布研究

为了解鸡白痢沙门菌中三型分泌系统-2（T3SS2）效应蛋白基因的分布情况。本研究采用PCR方法检测了在1962~2013年间从我国分离的237株鸡白痢沙门菌中25个T3SS2效应蛋白基因的分布特征;同时,通过序列比对分析了这25个基因在18株不同血清型沙门菌中的流行特征,它们的全基因组序列来自GenBank。PCR结果显示,在这237株菌株中,cigR、pipB、pipB2、slrP、sopD、sopD2、spiC、sseF、sseG、sseJ、sseK1、sseL、steA、steB、steC和steD均存在,gogB和sspH1均缺失,其它基因分布水平在5.9%~99.6%之间。序列比对分析结果显示,有15个基因在这18株菌株中均存在,sifB、sseK1、sspH2和steC在一些菌株中是假基因。结果表明,gtgE、sseI和sseK2在这237株菌株中分布具有一定的年代规律性;大部分被检测基因在鸡白痢沙门菌中具有广泛分布;一些基因在微进化过程中形成了假基因。

烟草青枯菌FQY_4三型分泌系统的效应蛋白因子分析

青枯菌三型分泌系统的效应蛋白因子是青枯菌致病的主要决定因子之一,三型分泌系统能将效应蛋白因子直接注入植物细胞内。为了解和掌握烟草青枯菌效应蛋白因子的信息,在烟草青枯菌FQY_4全基因组序列的基础上,通过效应蛋白因子数据库和软件分析了FQY_4株系的效应蛋白因子。结果显示,青枯菌FQY_4的染色体和巨大质粒上共编码74个效应蛋白因子,其中大多数效应蛋白因子只有一个拷贝,但是RipT,RipAM和RipTPS有多个拷贝,RipJ在染色体和巨大质粒上均能编码;青枯菌4个种系型(PhylotypeⅠ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ)中已完成基因组测序的11个株系具有32个核心效应蛋白因子。

大肠杆菌三型分泌系统2转录调节子EtrA对禽致病性大肠杆菌致病性的影响

【背景】禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是禽类主要病原菌之一,大肠杆菌三型分泌系统2(Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2)可通过转录调节子调控其致病性,但在APEC中转录调节子EtrA对其致病性的影响目前尚不清楚。【目的】研究ETT2中转录调节子EtrA对APEC致病性的影响。【方法】利用Red同源重组技术构建ETT2-etrA基因缺失株及回复株。比较生长性能、生物被膜形成、运动性及对血清敏感性的差异,基于RNA-Seq测序及Real-timePCR技术比较野生株和缺失株中与生物被膜形成、运动性以及毒力因子相关基因的转录水平。【结果】与野生株相比,缺失株及回复株生长特性无显著变化(P>0.05),但APEC40-ΔetrA生物被膜形成能力和对血清敏感性明显增强(P<0.001),运动性较野生株明显下降(P<0.01),回复株的表型有所回复。转录组学筛选出7个毒力差异基因,生物被膜形成相关基因显著上调,参与影响细菌运动性的基因显著下调。qRT-PCR验证与转录组学结果一致。【结论】etrA缺失可以显著影响APEC的生物被膜形成、运动性及对血清的敏感性,这可为进一步探讨ETT2对APEC的致病作用提供参考。

铜绿假单胞菌pfm基因对三型分泌系统效应蛋白的影响

【目的】检测铜绿假单胞菌基因pfm对三型分泌系统效应蛋白的影响。【方法】构建pfm基因互补菌株pfmC。提取野生株PAO1、敲除株Δpfm和互补株pfmC的RNA,利用Real-time PCR从转录水平检测效应蛋白ExoS、ExoT和ExoY转录水平的变化。以ExoS为代表,检测细胞内和分泌到细胞外效应蛋白的含量。收集铜绿假单胞菌PAO1、Δpfm和pfmC菌体内和分泌到细胞外的总蛋白,利用ExoS多克隆抗体进行Western杂交,特异检测ExoS的蛋白水平。【结果】与野生型相比,Δpfm中exoS、exoT和exoY转录水平明显降低,而pfmC中这3个蛋白的转录水平得到回补。Δpfm菌体内和分泌到细胞外的ExoS量均明显低于野生株PAO1,pfmC细胞内和细胞外分泌的ExoS蛋白量均得到恢复。【结论】铜绿假单胞菌基因pfm会影响三型分泌系统效应蛋白的水平。

青枯菌三型分泌系统研究进展

青枯菌(Ralstonia solanacearum)可导致多种重要经济作物毁灭性枯萎(bacterial wilt,又称青枯病),是世界上分布最广、危害最严重的十大植物病原细菌之一。注射器状的三型分泌系统(Type III secretion system)是青枯菌的一个决定性致病因子,青枯菌利用T3SS向寄主细胞中注射大量效应蛋白(Type III effectors)来抑制寄主的免疫反应,从而引起寄主感病。本文围绕近年来有关青枯菌T3SS遗传特性、表达调控、效应蛋白功能等方面最新进展进行综述,为全面了解青枯菌致病机理和植物细菌病害的防治提供新思路。

细菌三型分泌系统效应蛋白转运的研究进展

三型分泌系统(Type 3 secretion system,T3SS)作为存在于革兰氏阴性菌中的分泌系统之一,对革兰氏阴性菌的致病有重要作用。T3SS的致病作用体现在T3SS能直接将效应蛋白转运至宿主细胞,进而通过效应蛋白调控细胞的一系列通路,促进细菌定殖于细胞。而效应蛋白的转运受到两方面因素的调控,一方面是效应蛋白本身的信号序列,另一方面是T3SS相关蛋白的辅助。本文围绕近年来T3SS的构成、效应蛋白转运机制方面的最新进展进行概要综述。

细菌三型分泌系统输出蛋白分泌信号研究进展

自提出三型分泌系统的概念以来,相关分子机制的研究让人们对其有了更深入的了解。与依赖信号肽分泌途径形成鲜明对比的是,蛋白通过细菌三型分泌系统分泌或者转运时没有可识别的保守信号序列。近期对三型分泌蛋白的研究发现了多种可以引导其分泌的分泌信号。本文分别介绍了细菌三型分泌系统的种类,分泌系统分泌蛋白的种类,并着重阐述了分泌信号的分子特性及其机制,以期为新型抗菌药物的研发提供新的思路。

鼠伤寒沙门菌三型分泌系统效应蛋白SseK3生物学底物的鉴定及其功能的初步研究

目的鉴定SseK3蛋白宿主中新的生物学底物以及对其功能的影响。方法通过酵母双杂交系统(yeast-two-hybrid,Y2H)从HeLa cDNA文库中筛选SseK3潜在结合蛋白;通过细胞共表达和体外活性试验检测SseK3对底物蛋白的精氨酸N-乙酰葡萄糖胺化(Arg-GlcNAc)修饰;通过点突变检测SseK3对底物蛋白的修饰位点;通过免疫共沉淀试验检测底物蛋白的Arg-GlcNAc修饰对其互作蛋白结合能力的影响。结果酵母双杂交和基因测序结果表明,SseK3的一个全新底物是Snapin;SseK3在细胞内和体外均可以Arg-GlcNAc修饰Snapin;修饰位点位于Snapin蛋白C端的119和120位精氨酸;Arg-GlcNAc修饰Snapin抑制了Snapin-SNAP25的结合。结论本研究成功筛选到SseK3的一个新的宿主底物蛋白Snapin,初步研究了SseK3对Snapin的Arg-GlcNAc修饰及该修饰对Snapin功能的影响,为后续进一步理解细菌的Arg-GlcNAc修饰功能以及在病原微生物感染过程中的作用机制提供理论依据。

细菌三型分泌蛋白序列的分段特征提取研究

三型分泌系统广泛存在于动植物致病菌中,是最复杂的蛋白质分泌系统之一。三型分泌系统可以向宿主细胞分泌毒力因子,又称效应蛋白,从而导致疾病的发作。目前已知的三型分泌系统的效应蛋白很有限,它们并没有明确的分泌信号,识别较困难。本文主要介绍三型分泌系统效应蛋白的计算预测方法,根据其N端序列的特点,采取分段式的特征提取,取得了良好的预测效果。

减毒鼠伤寒沙门菌三型分泌表达系统的构建及其特性

为开发新型重组减毒鼠伤寒沙门菌口服活疫苗载体,本研究以pYA3493质粒为基础,用鼠伤寒沙门菌sopE_(Nt100)基因及其启动子替代原有的P_(trc)启动子,构建沙门菌三型分泌表达载体pYA-sopE_(Nt100);再将质粒pYA-sopE_(Nt100)电转入沙门菌ΔcrpΔasd SL1344,构建减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,研究其生物学特性,进一步将报告基因egfp克隆入sop E基因下游,构建重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100)-egfp),感染Vero细胞,用Western blotting分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统构建成功;生物学特性鉴定结果表明,其血清型与亲本株Δcrp SL1344及野生株SL1344保持一致;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度也更为缓慢;重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))的LD50较野生株SL1344降低了7.0×104倍;Western blotting结果发现,重组菌培养上清中能检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da);重组菌株感染Vero细胞后,可以同时检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da)和EGFP蛋白(27 k Da)。以上结果证实,本研究成功构建了新型减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,其能够有效递呈外源抗原,该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。

鼠疫耶尔森菌Ⅲ型分泌系统相关基因的功能研究

目的研究鼠疫耶尔森菌pCD1质粒上编码的假定蛋白YpCD1．08、YpCD1．09、YpCD1．16与pCD1质粒编码的Ⅲ型分泌系统（T3SS）在功能上的相关性。方法采用λ-Red重组系统构建鼠疫耶尔森菌YpCD1．08、YpCD1．09、YpCD1．16基因的突变株，通过测定分别培养于26℃下有钙、37℃下无钙和有钙TMH培养基中的以上3种突变菌株及野生菌株的生长曲线，分析突变菌株的低钙响应情况；在26℃和37℃条件下分别培养鼠疫菌突变菌株，并提取总RNA，采用定量PCR分析3种基因的转录水平及其对温度的依赖性；用β-内酰胺酶报告分子的方法分析3种基因的突变对效应蛋白转运的影响。结果在26℃和37℃低钙培养条件下，突变菌株△YpCD1．08、AYpCD1．09、△YpCD1．16的生长曲线与野生型菌株一致，表明其低钙响应正常。YpCD1．08、YpCD1．09、YpCD1．16基因在37℃与26℃转录水平的比值分别为2．3±0．3、2．3±0．5、3．2±0．7，表明这3个基因在鼠疫菌中均有转录，且其转录水平受温度调控，与T3SS基因转录水平的温度依赖性一致。β-内酰胺酶报告分子实验结果表明，突变菌株△YpCD1．08在140min时477与520nm波长的发光强度的比值为2．5，而野生型菌株仅为1．8，表明△YpCD1．08菌株对YopE的转运能力要高于野生株，而其他两个突变株与野生株类似。结论YpCD1．08、YpCD1．09、YpCD1．16基因有可能是T3SS的新成员，假定蛋白YpCDI．08可能参与效应蛋白YopE的转运及其调控。

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白HY322基因的克隆和生物信息学分析

本研究从溶藻弧菌中成功克隆获得HY322基因的编码区序列（GenBank：KX245317.1）,该基因全长969 bp,可编码322个氨基酸,应用生物信息学的方法和工具对溶藻弧菌HY9901效应蛋白HY322的理化性质、蛋白结构、遗传进化关系和抗原特性等方面进行预测和分析。结果表明：HY322蛋白为不稳定的亲水性蛋白,蛋白呈酸性,无跨膜区,无明显的信号肽;二级结构以α螺旋为主,进化分析显示溶藻弧菌HY9901与哈维氏弧菌（V.harveyi）聚为一支,表明在进化关系上最为接近。HY322序列中包含有一个与鞭毛形成有关的Fli N功能结构域。多种参数预测了HY322可能的B细胞抗原优势表位,分别是第32~33、100~102、138~140、215~216、235~238、246~249区段。利用SWISS-MODEL软件,得到了HY322亚基三维模型。本研究从生物信息学角度验证了HY322作为弧菌共同抗原的可行性,为下一步的疫苗研发提供了理论依据。

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白Va1686基因的克隆和生物信息学分析

本研究从溶藻弧菌中成功克隆获得Va1686基因的编码区序列（GenBank：KX245316），该基因全长1164bp，可编码387个氨基酸，应用生物信息学的方法和工具对溶藻弧菌HY9901III型分泌系统效应蛋白Va1686的理化性质、蛋白结构、遗传进化关系和抗原特性等方面进行预测和分析。结果表明：Va1686蛋白为稳定的亲水性蛋白，蛋白呈酸性，不具有跨膜区和信号肽，二级结构以仅螺旋为主。进化分析显示溶藻弧菌HY9901与哈维氏弧菌（V．harveyi）聚为一支，表明在进化关系上最为接近。Va1686蛋白包含一段与细胞分裂相关的Fic superfamily保守结构域。生物信息学分析表明Va1686可能的B细胞抗原优势表位，分别是第48～49、82～85、125～126、150～153、185～186、236～237等区段。利用SWISS-MODEL软件，模拟了Va1686亚基三维结构模型，发现与其同源蛋白副溶血弧菌vopS非常相似，相似度达到89．46％。本研究从生物信息学角度分析了Va1686作为弧菌共同抗原的可行性，为下一步的疫苗研发提供了理论依据。

铜绿假单胞菌PA14 H3-T6SS的调控功能研究

【目的】研究模式病原细菌铜绿假单胞菌PA14(Pseudomonas aeruginosa PA14)第三套六型分泌系统(H3-T6SS)的调控机制和在环境适应等方面的功能,为该菌致病机制研究和治疗方案开发奠定基础。【方法】以铜绿假单胞菌PA14为研究对象,利用凝胶迁移阻滞试验(EMSA)验证σs因子(RpoS)与H3-T6SS启动子区的结合能力;构建rpoS敲除菌株(ΔrpoS)及回补菌株(rpoS),用启动子酶活试验研究RpoS对H3-T6SS表达的调控作用;构建H3-T6SS关键组分clpV3敲除菌株(ΔclpV3)及回补菌株(clpV3),测定其在酸、渗透压等不同胁迫下的细胞存活率;检测H3-T6SS对铜绿假单胞菌PA14生物膜形成和运动能力的影响。【结果】RpoS蛋白可以直接结合H3-T6SS启动子区;成功构建了铜绿假单胞菌PA14的rpoS和clpV3敲除菌株及回补菌株,RpoS正调控H3-T6SS的表达,H3-T6SS有助于细菌抵抗酸胁迫,但对渗透压胁迫响应不明显;H3-T6SS可显著增强细菌的生物膜形成和运动能力。【结论】铜绿假单胞菌PA14的H3-T6SS受调控因子RpoS的正调控,在增强细菌抗酸胁迫、生物膜形成和运动能力等方面有重要作用。

鹦鹉热衣原体致病机制研究进展

鹦鹉热衣原体（Cps）是一种专性真核细胞内寄生,有独特的二相型发育周期,可形成具有感染能力的原体（EB）和具有繁殖能力的网状体（RB）,革兰染色阴性的细菌。Cps归类于衣原体科中的衣原体属,早期Everett等将其归类为嗜衣原体属,国内虽一直沿用这样的分类体系,但国际衣原体委员会已明确Cps属于衣原体属,同时取消嗜衣原体属分类。