应用三引物荧光PCR-Sanger测序法检测FMR1全突变者和前突变携带者

目的检测脆性X综合征患者或携带者FMR1基因5′非编码区CGG序列的重复数。方法应用三引物荧光PCR-Sanger测序法检测一例男性脆性X综合征疑似患者和一名外表正常孕妇及胎儿羊水样本，并选择阳性对照和阴性对照进行可靠性验证。结果三引物荧光PCR-Sanger测序法可准确检出阴性及阳性对照的FMR1基因CGG的重复数。男性受检者CGG的重复数大于200，判断为全突变患者；孕妇CGG重复数为35和115，判断为杂合型前突变携带者；胎儿羊水CGG的重复数大于200，判断为男性全突变胎儿。经家属知情同意，对流产胎儿进行检测，证实了上述产前诊断结果。结论三引物荧光PCR-Sanger测序法可作为基层常规临床检测脆性x综合征患者／前突变携带者FMR1基因CGG重复数的快捷有效可靠方法，同时也适合在基层实验室用于大规模筛查前突变携带者候选人群。

建立一种EGFR突变检测的凸环引物荧光PCR新方法

目的建立一种能快速、有效检测EGFR突变的凸环引物荧光PCR新方法。方法同时用凸环引物荧光PCR技术法和Sanger测序法对混有不同比例的EGFR突变型质粒的样本进行对照检测,以对比两者灵敏度;采用两种方法对93例肺癌组织的EGFR基因进行热突变位点E746-A750del和L858R的检测,并统计其符合率。结果在93例肺癌组织的DNA中,凸环引物荧光PCR技术法和Sanger测序法检测到EGFR突变分别为29例(E746-A750del 15例,L858R14例)和28例(E746-A750del 15例,L858R 13例),符合率达96.6%,且凸环引物荧光PCR技术法能检测出混有5%突变质粒型的样本,其灵敏度达5%,比Sanger测序法高。结论凸环引物荧光PCR技术法比测序法更为简便,且灵敏度更高,易于实现,2小时内即可得出准确结果。

建立一种N-ras突变检测的“凸背”引物荧光PCR新技术

目的建立一种简便、省时、有效的N-ras突变检测的＂凸背＂引物荧光PCR新技术。方法对比＂凸背＂引物荧光PCR新技术和Sanger测序法：通过对混有不同比例的N-ras基因热突变G13D（GGT〉GAT）质粒的样本进行对照检测来比较两者的灵敏度;对97例急性髓细胞白血病（AML）患者的外周血的DNA进行N-ras的G13D突变检测,统计两者的符合率。结果 ＂凸背＂引物荧光PCR新技术能检测出混有5%突变质粒型的样本,其灵敏度达5%,高于Sanger测序法的10%~20%。在97例AML患者的外周血的DNA中,＂凸背＂引物荧光PCR新方法和Sanger测序法检测到N-ras基因G13D突变分别为19例和18例,符合率达94.7%。结论 ＂凸背＂引物荧光PCR新技术比测序法更为快速、简单,有更高的灵敏度,容易实现。

影响荧光终止法PCR循环测序反应的因素

比较了一些影响荧光终止法PCR循环测序反应的因素。实验结果显示在BeckmanCEQ2 0 0 0自动测序仪上 ,可读序列长度随着pUC18模板量增加而逐渐增多 ,当模板量达到 12 5ng时DNA可读序列最长 ,以后随着pUC18量增加测序长度逐渐下降。当引物量是 1μl时 ,其测序结果比用 0 .5μl引物时好。在同样模板量情况下 ,10 μl反应体积比 5

第三代测序技术简介

Heliscope单分子测序技术与SMRT技术都是基于边合成边测序的思想。Heliscope单分子测序仪,将待测序列打断成小片段并在3′末端加上Poly（A）,在另一端加上Cy3荧光标记。然后与表面带有寡聚Poly（T）的平板杂交。再加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应,每轮加一种dNTP。洗脱后检测,用荧光信号判断反应位置碱基。用化学试剂去掉荧光标记,

TP-M13自动荧光检测法在高粱SSR基因型鉴定中的应用

研究利用TP-M13自动荧光检测法对48份高粱材料进行了简单序列重复(SSR)标记的基因型鉴定。在这个方法中,需要合成一个普适性的用荧光(如FAM)标记的M13引物,并把M13的正向引物和一个SSR反向引物相连(称为TP-M13引物),利用3条引物序列进行PCR扩增,其PCR产物在DNA测序仪(如ABI3700仪)上进行自动荧光检测。结果表明,这种方法和其他的传统方法相比,具有经济、灵敏、高效的优点。建议在利用数量很多的SSR标记对数量有限的基因组较小的材料进行基因型鉴定时,使用TP-M13自动荧光检测系统。

应用Q-PCR定性检测KIR基因有无方法的建立

目的建立定性检测KIR基因有无的Q-PCR方法。方法根据高分辨水平中国人群KIR等位基因的多态性,并参考国际IPD-KIR数据库,针对16种KIR基因及2DS4-Normal、2DS4-Deleted两种亚型,设计KIR基因特异性引物用于Q-PCR扩增反应;同时设置一孔阴性对照、一孔阳性对照(特异性扩增人体生长激素HGH基因片段),以监控假阳性、假阴性的结果。为验证Q-PCR方法的可靠性,随机选择302份已采用KIR PCR-SSP商品化试剂盒检测的标本,采用Q-PCR方法盲检和对比。结果300人份的Q-PCR检测结果与已知的PCR-SSP检测结果相符,有2份标本结果不一致,其中1例标本的2DS5基因Q-PCR检测结果为阴性,而PCR-SSP检测结果为阳性;另一例标本2DS1基因Q-PCR检测结果为阳性,而PCR-SSP检测结果为阴性。对2份标本分别进行2DS5、2DS1基因测序分型,证实Q-PCR定性检测结果正确。结论本文建立的KIR Q-PCR方法结果准确、可靠,可用于KIR基因有无的定性检测。

新疆野扁桃TP-M13-SSR的引物开发研究

该试验自主设计新疆野扁桃TP-M13-SSR引物,从中筛选多态性最佳的引物以供后续研究使用。从该植物的5个居群中分别挑选2份叶片提取基因组DNA,扩增后的产物使用毛细管电泳荧光检测并分析。经分析可得出12对新疆野扁桃TP-M13-SSR引物的期望杂合值(He)、观测杂合值(Ho)、等位基因数目(Na)、香农指数(I)、固定指数(F)、多态性信息含量指数(PIC)的范围分别为0.656~0.859、0~0.281、3.796~9.580、4~8、1.213~2.014、-0.164~1、0.605~0.843。在所有以上引物中,引物PT-6除固定指数外的所有信息数据均为最高。共筛选出12对多态性信息丰富的TP-M13-SSR引物,扩增片段大小在100~300 bp之间,多为两碱基重复。

DNA简单重复序列基因分型的新方案

随着大规模测序技术的不断发展,测序成本降低,各种生物的基因组序列已逐步完善,重测序工作成为基因多态性研究中非常重要的方法。它可以比较全面地描述基因的复杂性和多样性,广泛应用于多种疾病的检测和鉴定等。但是,当重测序过程中遇到简单重复序列时,往往会出现峰谱图的滑移现象,使测序结果不准确。本研究利用荧光标记引物定向扩增包含重复序列的片段,结合ABI 377 DNA自动测序仪进行检测重复单位,结果表明,该方法可以准确无误的检测出重复序列的重复次数,是对重测序工作中的重复序列分型技术的一项重要补充。

高通量测序确诊9p部分三体综合征一例

目的 确定1例生长发育迟缓、语言发育障碍及智力障碍患儿的致病原因.方法 应用常规外周血淋巴细胞培养G显带对患儿及父母核型分析后,进一步采用高通量测序(next generation sequencing,NGS)技术对患儿进行全基因组测序分析,确定核型分析中无法明确的多余片段的来源,并采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术验证.结果 G显带分析显示患儿染色体核型为47,XX,+mar,患儿父母核型未见异常.NGS提示患儿多余片段来自9p13.1p24.3(10001~39786086),重复片段的长度约39.77 Mb,FISH验证结果一致.结论 患儿核型中的衍生染色体片段源自9号染色体短臂,其异常表型归因于9p13.1p24.3三体.细胞遗传学联合NGS和FISH技术有助于准确鉴别异常染色体来源,可为临床诊疗提供准确的遗传学依据.

高通量基因测序提示18三体高危确诊46,XY,add（3）（p26.3）一例

胎儿 孕21周,系第1胎,有保胎史,高通量基因测序提示18三体高风险,风险指数为1/5.父母为非近亲婚配,表型正常,孕4周时感冒1次,未用药,无其他不良因素接触史,无家族病史.产前诊断：在签署知情同意书后,孕妇行羊膜腔穿刺术,进行羊水细胞的荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridization,FISH）检测和常规细胞培养G显带分析胎儿染色体核型.FISH检测结果：13、18、21及性染色体数目均正常（图1）.细胞培养核型分析为46,XY,add（3）（p26.3）（图2）.

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S418_(1515)。序列分析表明S418_(1515)为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40%,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S418_(1515)转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。

一种利用DSA-FACE分析寡糖链的方法

目的:优化糖链结构分析方法,满足高通量、高灵敏度和快速分析糖基结构的要求。方法:基于DNA测序仪的荧光糖电泳(DSA-FACE),将糖蛋白经过糖苷酶酶切获得糖链,并与荧光标记物8-氨基芘基-1,3,6-三磺酸(APTS)进行衍生化反应,标记样品经过Sephadex-G10、HPLC纯化后,用DNA3100测序仪电泳分离,用Genescan3.7软件进行数据分析。结果:利用DSA-FACE技术分析了标准品Man5GlcNAc2和Gal2GlcNAc2Man3GlcNac2,并得到糖蛋白牛核糖核酸酶B的5种N-糖基结构(Man5～9GlcNAc2)。结论:DSA-FACE是分析糖基结构的有效技术手段,能够实现对糖基结构的高通量、高灵敏度和快速分析。

人自噬基因hAPG_(12)的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的:探讨克隆人自噬基因h APG12 ,构建重组真核表达载体p EGFP- C2 -h APG12 ,为进一步研究h APG12 的功能奠定基础。方法:从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,采用两步法RT- PCR,首先把RNA逆转录为c DNA,而后通过一对h APG12 的特异性引物扩增出目的基因,PCR产物与测序载体p UC18连接后转化到大肠杆菌DH5 α,而后对单菌落进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。将测序正确的h APG12 亚克隆入真核表达载体p EGFP-C2 ,该重组载体转化到大肠杆菌DH5 α后进行菌落PCR和酶切鉴定。结果:测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的h APG12 c DNAs含有2 2 5个碱基,与Genbank( BC0 1 1 0 33)序列完全一致。构建的重组真核表达载体经鉴定证实h APG12 基因已完全正确亚克隆到p EGFP- C2 。结论:成功克隆了人自噬基因h APG12 并构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白( EGFP)基因的重组真核表达载体p EGFP- C2 - h APG12 ,为以后研究h APG12

两例无创产前基因检测假阳性病例的分析

目的分析2例无创产前基因检测假阳性病例，为患者提供精确的染色体诊断结果。方法应用传统细胞核型分析、荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）及大规模并行基因组测序技术（massively parallel sequencing, MPS）对2例无创基因检测分别提示XO（＋＋＋）和T18（1／20）XO（＋）的胎儿进行检测分析。结果例1的无创基因检测结果提示为x0（＋＋＋），经羊水细胞传统核型分析、胎盘FISH检测及胎儿组织MPS检测后确诊为胎盘特异性嵌合的超雌综合征嵌合体，核型为47，XXX／46，XX。例2的无创产前基因检测结果提示为T18（1／20）XO（＋），经脐带血核型分析、MPS、FISH检测后确诊为特纳综合征，核型为45，X[48]／46，X，der（x）del（x）（p11．21）del（x）（q13．3）[62]。结论无创基因检测对于胎儿性染色体及18三体高危存在假阳性，提示在产前诊断中应合理联合应用各种不同的细胞分子遗传学技术进行分析。

SNaPshot技术检测乙型肝炎病毒基因组P基因区单核苷酸多态性的研究

目的 建立SNaPshot技术对乙型肝炎病毒(HBV)基因组P基因区单核苷酸多态性(SNP)的分析。方法 针对HBVYMDD变异位置的上、下游设计引物,用PCR方法进行DNA扩增,产物直接测序或克隆测序。再针对变异位点74 1A G变异型(YVDD)和74 3G T变异型(YIDD)的紧邻上游设计高度特异的SNaPshot检测引物,用不同荧光标记的ddNTP对PCR产物进行一步延伸,然后置于310型DNA测序仪上观察荧光信号,可直观的检测上述两位点的单核苷酸多态性。结果 在拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者中,经测序证实P基因区不仅存在74 1、74 3位点的变异,还存在5 14C A、5 2 3C A、5 6 2T A、6 6 7C A等位点的变异。对已证实P基因区变异的13例患者血清用SNaPshot技术检测YMDD结果与测序结果完全相同,显示SNaPshot技术高度的特异性。结论 SNaPshot技术检测HBV基因组SNPs具有快速、简便、准确特异的特点,还检测到野生株和变异株的混合存在。