加工食品中花生蛋白夹心酶联免疫吸附测定的前处理方法探究与改进

目的构建一种可配合花生蛋白夹心酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒实现对于加工食品中花生成分可靠检测的高质量样品前处理方法。方法对9种不同pH的提取缓冲液提取未处理、湿热处理、干热处理花生蛋白效果进行比较分析以确定最优提取缓冲液类型。而后,将吐温-20、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)以单独或组合添加的方式加入上一步获得的最优提取缓冲液中,提取3组花生蛋白,并对提取效果与夹心ELISA试剂盒检测花生蛋白回收率进行比较分析以确定最优添加剂配方。结果最终确定添加0.2%SDS和0.1%吐温-20的碳酸盐缓冲液(50 mmol/L,pH 9.6)为最优提取缓冲液。向碳酸盐缓冲液中加入SDS、吐温-20较好地提升了花生蛋白的提取率和回收率,将湿热处理花生蛋白回收率提高了2倍以上。结论本研究实现了对商业加工食品中花生成分的可靠检测,为推动过敏原信息在食品标签的准确标注提供了技术支撑,也为相关研究提供了参考。

抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli L-天冬酰胺酶及药代动力学研究

目的 建立大鼠血浆中重组E .coliL 天冬酰胺酶的抗体夹心酶联免疫吸附测定法 ,并进行药代动力学研究。方法 应用重组E .coliL 天冬酰胺酶免疫家兔 ,分离IgG ,用DEAE 纤维素柱色谱纯化 ,辣根过氧化物酶标记抗体 ,建立抗体夹心酶联免疫吸附法 ,测定大鼠血浆中重组E .coliL 天冬酰胺酶浓度。结果 方法的线性范围为 1～6 4U·L- 1 ,血药浓度与时间的关系符合二房室模型 ,初期和末端的T1 2 分别为 0 5 0～ 0 5 7h和 2 4 5～ 3 0 2h ,AUC与剂量成正比。结论 建立的抗体夹心酶联免疫吸附法在灵敏度、特异性、线性范围、精密度和回收率等方面 ,满足药代动力学研究要求。实验方法和重组E .coliL

抗体夹心酶联免疫吸附法测定鸡白细胞介素-2

利用抗鸡白细胞介素-2(ChIL-2)单克隆抗体作包被抗体、生物素标记的抗ChIL-2多克隆抗体作检测抗体建立了一个抗体夹心酶联免疫吸附测定系统.此系统对鸡白细胞介素-2的检测灵敏度为50 pg/mL.两种抗体与鸡干扰素-α和人白细胞介素-2等细胞因子不产生任何非特异性反应.以不同种类的促有丝分裂剂或鸡病毒刺激鸡淋巴细胞,培养液中分泌产生的天然鸡白细胞介素-2的量用此系统检出.在促有丝分裂剂中,植物血凝素(PHA)导致ChIL-2的产生量最高;在病毒方面,传染性法氏囊病毒最能促使ChIL-2的分泌.本研究建立的抗体夹心酶联免疫吸附测定系统为我们以定量方式测定鸡白细胞介素-2提供了一个灵敏度高、特异性好的工具.

三唑磷酶联免疫吸附测定法中包被抗体稳定剂的研究

选择了甘油、山梨醇、聚乙二醇（PEG）、卵清蛋白（OVA）、多肽、糖、氨基酸等试剂,通过经验法和正交法相结合的手段配制了一系列稳定剂,对吸附在酶标板上的三唑磷多克隆抗体进行处理（37℃,1h）后,再在37℃下连续贮存7d,利用直接竞争ELISA法对不同稳定剂处理的包被抗体免疫活性、亲合性及检测灵敏度进行检测,并与未经稳定剂处理的对照进行比较,筛选得到效果较好的稳定剂1（质量分数：甘油2.5%,氨基酸1.5%,蛋白胨3.0%,离子螯合剂0.1%,防腐剂0.01%）。用稳定剂1处理包被抗体后,4-6℃下保存半年及37℃下保存14d的试验结果表明,抗体的活性相对保持率分别为97.8%和94.2%;其免疫活性、亲合性（I50分别为68.43和54.38ng/mL）及灵敏度（I10分别为3.72和3.22ng/mL）与常规方法包被的抗体（包被好后不贮存,直接检测,I50为60.73ng/mL,I10为3.11ng/mL）无明显差异;冻融试验表明,经稳定剂1处理的三唑磷抗体在反复冻-融次数不超过8次时其活性也是稳定的。说明筛选出的稳定剂可以显著提高三唑磷多克隆包被抗体的稳定性,可用于三唑磷ELISA试剂盒的生产。

抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组溶葡萄球菌酶研究

用重组溶葡萄球菌酶免疫家兔获得抗血清，经亲和层析纯化后用HRP标记，以双向免疫扩散法确定抗血清效价。以Western blot鉴定抗体的特异性，建立双抗夹心法标准曲线，鉴定其最小检出限、精确度、回收率。实验显示多克隆抗体能与溶葡萄球菌酶特异性结合，双抗夹心ELISA法检测抗原的最小检出限为0．98ng／mL，标准曲线在0．98～500ng／mL范围内线性良好。3份同批样本分别重复6次测定，平均批内变异系数为6．4％；3份不同批样本分别重复6次测定，平均批间变异系数为6．5％。血清中加入已知量的标准抗原，测得平均回收率为98．6％。此法检测重组溶葡萄球菌酶的可测范围广，灵敏度和精密度高，变异系数较小。结果证实建立的检测血清中重组溶葡萄球菌酶含量的双抗夹心酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent asaay，ELISA）灵敏、准确、可靠。

甜菜丛根病的双抗体夹心酶联免疫吸附测定

对甜菜丛根病毒采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定(Double antibody sandwich assay,DAS-ELISA)法进行了检测,并对测定方法及检测结果进行了分析讨论。

间接竞争酶联免疫吸附测定法快速筛查药酒中双氯芬酸

目的建立间接竞争酶联免疫吸附测定法快速筛查药酒中双氯芬酸(diclofenac,DCF)。方法采用活性酯法和混合酸酐法分别将DCF与载体蛋白耦合,得到DCF的免疫原和检测抗原。采用DCF-牛血清白蛋白免疫BALB/c小鼠,随后用杂交瘤等技术制备抗DCF单克隆抗体(monoclon alantibody,mAb),基于DCFmAb建立了间接竞争酶联免疫吸附测定法,对该检测方法的性能(准确度、精密度和特异性)进行鉴定。结果紫外扫描结果表明DCF已成功与载体蛋白偶联;获得最优株抗DCF的杂交瘤细胞株(4B9),其IC50值为0.61ng/mL;该检测方法在药酒中的DCF平均添加回收率为85.9%,其批间变异系数(coefficient of variation,CV)(5.3%~9.7%)均大于批内CV(4.9%~9.1%),与类似物(酮洛芬、阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、舒林酸、萘普生、罗非昔布)没有交叉反应。结论本研究建立的间接竞争ELISA法为DCF在药酒中的残留提供了一种新的筛查手段。

犬粪便棘球绦虫抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测法建立与应用

目的研究双抗体夹心酶联免疫吸附检测犬粪便棘球绦虫虫体抗原的方法并评价其在实际工作中的应用价值。方法实验犬12只，分实验组和对照组，实验组用活化绵羊源原头蚴（G1型）作人工感染；感染后0～8周内收集粪便，56d宰杀实验犬，收集成虫；制备成虫抗原和虫体代谢／分泌抗原，蛋白酶K处理抗原并分别免疫成年绵羊和新西兰白兔；绵羊抗血清用80％饱和硫酸铵沉淀、透析，兔抗血清过IgG亲和层析柱，分别获得纯化抗体；观察犬粪便在PBS液中-80℃冷冻3d或在含1％Formalin的PBS液中70℃～80℃加热8h的处理方法对检出结果的影响。运用该方法对四川省甘孜县达通玛区4个乡的580只家犬吡喹酮每6月一次驱虫前后的粪抗原进行监测。结果试验系统的敏感性为92．3％，特异性为80％；粪抗原从感染后的第2～3周可检出；两种样品处理方法都可以灭活虫卵但不影响检出效果；检测方法可同时用于对细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫感染的诊断；达通玛区家犬粪抗原阳性率从2000年的50％下降到2005年的17％。结论检测方法具有较高的特异性和敏感性；推荐粪便用加热的方法处理可以灭活虫卵以防止生物污染；该方法可以在基层推广应用。

酶联免疫吸附双抗原夹心法检测人畜布氏菌抗体的研究

目的为人畜布氏菌病血清学诊断、监测及流行病学调查提供实用和简便的一种酶免疫试验技术。方法在制备高滴度布氏菌抗原辣根过氧化物酶结合物及其冻干制品基础上,应用酶联免疫吸附双抗原夹心法即双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)、试管凝集试验(SAT)及虎红平板凝集试验(RBPT)对从山西省布氏菌病疫区收集的布氏菌病患者、布氏菌感染羊、牛、猪以及健康人、羊、牛、猪共计290份血清进行对比检测。结果上述3种试验对健康人、羊、牛、猪共计140份血清检查均为阴性反应,用DAgS-ELISA对布氏菌感染人、羊、牛、猪共计150份血清检查,其阳性率分别为91.4%、74.6%、66.7%及66.7%,从总体而言,检查的特异性及敏感性,以DAgS-ELISA优于SAT及RBPT。结论双抗原夹心酶联免疫吸附试验检测人畜布氏菌抗体,不仅特异、敏感、简便,而且制备一种布氏菌抗原酶结合物及其冻干制品,可用于人及各种动物布氏菌抗体的检测,值得推广应用。

双抗体夹心酶联免疫吸附法检测鱼糜制品中鸡蛋卵白蛋白

目的建立双抗体夹心酶联免疫吸附(sandwich enzyme linked immunosorbent assay,sELISA)法检测鸡蛋卵白蛋白(ovalbumin,OVA)的方法,组装定量检测鱼糜制品中OVA含量的ELISA检测试剂盒。方法确定各步骤反应时间,使用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度,建立检测方法并对其性能进行评价。结果反应最佳条件为:抗原孵育20 min,检测抗体孵育20min,酶促反应显色10 min。兔抗OVA抗体为捕获抗体,工作质量浓度为1μg/mL,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记兔抗OVA抗体为检测抗体,1:5000(V:V)稀释。采用四参数逻辑曲线拟合标准曲线,所建立sELISA方法的检测范围为8.5~200.0 ng/mL,检出限为3.5 ng/mL,定量限为8.5 ng/mL。批次内和批次间的变异系数分别为2.31%~4.58%和6.06%~12.23%;鱼糜基质中的回收率为80%~130%;测得28种常见食物样品中4种样品的交叉反应率小于0.002%;试剂盒在4℃保存6个月期间,标准品检测结果的变异系数为4.29%~18.91%。结论建立的方法快速、灵敏、准确、稳定性好,可用于鱼糜制品中鸡蛋OVA的定量检测。

灵芝酸A多克隆抗体制备及酶联免疫吸附测定法的建立

以牛血清白蛋白为载体,采用活化酯法合成灵芝酸A的偶联抗原作为免疫原,按照免疫程序接种试验兔,获得针对偶联抗原的多克隆抗体。对多克隆抗体的效价及靶向进行分析后,构建灵芝酸A的间接竞争酶联免疫吸附测定法。结果显示:多克隆抗体中存在靶向偶联抗原3个区域的独特型抗体,总效价为1∶78 125,其中抗灵芝酸A特异性抗体效价为1∶3 125。间接竞争酶联免疫吸附测定法的灵芝酸A检出限为0.3μg/L,半数抑制浓度为4.0μg/L,线性范围在0.6~27.3μg/L之间。样品测定批间变异系数低于10%,样品加标回收率在82.9%~118.6%之间,对22份灵芝粉剂产品的测定结果显示不同品牌产品中灵芝酸A含量的差异极显著,该法测定结果与高效液相色谱法的测定结果相比,相关系数为0.972。结果表明,间接竞争酶联免疫吸附法测定灵芝酸A可行,该方法能够为灵芝保健品市场中相关产品的质量监控提供一种辅助方案。

电化学发光免疫测定与酶联免疫吸附试验检测抗环瓜氨酸多肽抗体比较

目的分析酶联免疫吸附试验(ELISA)和电化学发光免疫测定(ECLIA)检测抗环瓜氨酸多肽抗体(抗CCP抗体)的结果,并评价两种方法检测结果的一致性。方法应用ELISA和ECLIA同时检测145例类风湿关节炎(RA)患者(含25例早期RA患者)、155例其他风湿免疫性疾病患者(包括50例骨性关节炎、35例强直性脊柱炎、30例干燥综合征、20例系统性红斑狼疮、10例原发性胆汁性肝硬化和10例系统性硬化症)、50例其他疾病患者和50例健康对照者共400例血清样本的抗CCP抗体含量。用SPSS13.0统计软件对结果进行一致性、敏感性及特异性分析,并分别对3例ECLIA检测高浓度抗CCP抗体血清样本做1∶20、1∶30、1∶40、1∶80和1∶160稀释后进行线性分析。结果 ELISA和ECLIA检测400例血清样本抗CCP抗体的一致性极好;两种方法检测RA患者抗CCP抗体的敏感性和特异性近似,ECLIA分别为77.24%和98.00%,ELISA分别为76.55%和98.00%。3例ECLIA检测高浓度抗CCP抗体血清样本线性回归分析结果显示,样本浓度稀释至1∶160,线性R2值均>0.9。结论 ECLIA和ELISA检测抗CCP抗体具有较好的一致性,且ECLIA线性范围较宽,ECLIA检测抗CCP抗体具有良好的应用前景。

单克隆抗体酶联免疫吸附抑制试验测定C1m(f)因子及成都地区汉族频率调查

作者用抗G1m(f)单克隆抗体,建立检测人类免疫球蛋白同种异型G1m(f)因子的酶联免疫吸附抑制试验.同时调查了成都地区汉族群体G1m(f)因子的频率.在478份样本血清中,G1m(f)因子阳性占83.26%,计算G1m(f)的基因频率为0.5909,方差为0.0004.

电鳐乙酰胆碱酯酶标记第二抗体酶联免疫吸附测定法

目的:以电鳐乙酰胆碱酯酶标记二抗,建立该酶的酶联免疫吸附方法。方法:采用改良高碘酸钠氧化法。结果:标记过程中对AChE的酶活性影响较大的因素有pH值,温度以及NaIO4浓度。AChE酶标记的羊抗小鼠IgG的效价至少高于HRP,酶标记的羊抗小鼠IgG一个数量级。结论:制备的乙酰胆碱酯酶标记第二抗体在酶联免疫吸附测定法中高效地取代辣根过氧化物酶及碱性磷酸酶标记第二抗体。

双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测布氏菌抗原的实验研究

目的 建立检测布氏菌抗原特异、敏感和快速的试验方法。方法 在制备高滴度布氏菌抗体辣根过氧化物酶结合物及其冻干制品基础上 ,建立检测布氏菌抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验 (DAbS -ELISA) ,包括常规DAbS -ELISA及快速DAbS -ELISA。用建立的两种DAbS -ELISA法对布氏菌菌体抗原及可溶性抗原进行有关其特异性及敏感性对比观察 ;同时对模拟的这些抗原污染的饮用水标本进行对比观察。结果 常规DAbS -ELISA检测布氏菌 5 44A、16M、13 3OS及 10 4M的菌体抗原以及布氏菌 16M可溶性抗原的敏感性分别为 0 .2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190万菌 /ml、2万菌 /ml和 0 .0 12 μg/ml ;用快速DAbS -ELISA法的敏感性分别为 2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0万菌 /ml和 1.2 μg/ml;同时用这两种DAbS -ELISA检测上述抗原污染的饮用水标本其敏感性分别为 0 .2 2万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0万菌 /ml和 0 .0 12 μg/ml ;以及 2 2万菌 /ml、12 0万菌 /ml、190 0万菌 /ml、2 0 0万菌 /ml和 1.2 μg/ml。而且这两种DAbS -ELISA法检测不含布氏菌抗原的所有对照均为阴性反应。结论 双抗体夹心酶联免疫吸附试验是检测布氏菌抗原的特异、敏感、快速和适用的试验方法。

胰岛素瘤相关蛋白-2自身抗体酶联免疫吸附测定方法的建立

目的:建立糖尿病患者血清中胰岛素瘤相关蛋白鄄2(IA鄄2)自身抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。方法:以链亲和素预包被的聚苯乙烯微量滴定板为固相载体,原核表达的生物素酰化IA鄄2胞内段融合蛋白为抗原,辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG为二抗,2,2’鄄连氮鄄双鄄[3鄄乙基苯并噻唑啉磺酸](ABTS)为显色底物建立ELISA。结果:本方法的平均批内变异系数为8.8%,批间变异系数为7.7%。用该方法和Roche公司生产的“DiapletsAnti鄄IA鄄2”IA鄄2自身抗体酶联免疫试剂盒进行对比,共检测218例糖尿病患者,以Roche试剂盒的检测结果为准,本方法的诊断灵敏度为92.1%,特异度为98.9%。结论:本研究建立的IA鄄2自身抗体ELISA法有较好的灵敏度、特异度和精密度,且操作简单方便,有较广阔的应用前景。

小麦胚乳贮藏蛋白多克隆抗体间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)的建立

通过对比试验研究了蛋白提取液、提取时间、还原剂DTT、封闭液、包被物与抗体浓度等对小麦胚乳贮藏蛋白多克隆抗体的影响,建立了适宜于小麦胚乳醇溶蛋白(G liad in)和低分子量谷蛋白亚基(Low molecu lar we ight glute-n in subun it,LMW-GS)多克隆抗体的间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

单克隆抗体酶联免疫吸附抑制试验测定精斑G2m(n)因子

人类免疫球蛋白同种异型(human immuhoglobulin allotypes)包括Gm、Km及Am等系统。在法医学实践中可用于个人识别和亲子鉴定。关于人精液中同种异型因子的检测报道极少，我们应用抗G2m(n)因子的检测国内外均未见报道，我们应用抗G2m(n)单克隆抗体建立了测定精液及精斑G2m(n)因子的酶联免疫吸附抑制试验。现报道如下。