逆转录病毒载体pOZ-KLF5的构建及鉴定

为研究KLF5的相互作用蛋白从而深入探索其生物功能,构建了C端带有FLAG、HA、6x His三标签的p OZ-KLF5真核表达逆转录病毒载体。p OZ-KLF5载体可通过一次转录得到双顺反子转录单位,即一个转录物能表达两种独立存在的蛋白质:三标签融合蛋白KLF5-3x Tag和筛选标记——白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)。通过偶联IL-2Rα抗体的磁珠成功筛选出KLF5-3x Tag表达阳性的293T细胞,经Western-blot检测细胞内KLF5-3x Tag表达情况及其对293T细胞增殖及周期的影响,发现KLF5-3x Tag能够促进细胞克隆的形成并使S期细胞增多,且可被已知E3泛素连接酶WWP1降解,与已有报道一致。进一步通过免疫沉淀实验证明了与KLF5融合的标签的免疫反应性。该质粒的成功构建为研究KLF5相互作用蛋白及深入探索其生物功能奠定了基础。