通过构建三段T-DNA载体高频率获得无标记转基因大豆植株的研究

高频率获得无选择标记转基因植株有利于转基因植物的环境释放和安全性生产，农杆菌介导的共转化法是获得无标记转基因植株的方法之一。含二段T-DNA载体的共转化法已被人们成功应用，而二段以上T-DNA载体的共转化法还未见报道。基于这一目的，通过几个中问质粒构建了含有三段T-DNA的双元表达载体pNB35SVIP1，其中包含1个拷贝bar基因选择标记基因表达盒和2个拷贝VIP1目的基因表达盒。利用EHA101农杆菌菌系介导法转化大豆子叶节，经过在含3～5mg／L glufosinate培养基上多次筛选，获得了一定数量抗性再生植株，然后对抗性再生植株进行叶片涂抹除草剂、Southern blot和Northern blot检测，共鉴定出51棵T0代转基因植株，转化频率0．83％～3．16％，二个基因的共转化频率为86．4％。在对T1代群体进行叶片涂抹除草剂检测的基础上，不抗除草剂植株进行PCR、Southern blot和Northern blot检测，共鉴定出41棵无选择标记转基因植株，无标记植株获得率为7．6％。检测结果还表明，T1代群体中22．7％的株系发生了基因丢失现象，27．3％的株系发生了bar基因沉默现象，目的基因在37．1％的无标记植株中发生了沉默现象。三段T-DNA的双元表达载体是获得无标记转基因植株的理想途径。

几种植物转基因表达载体的构建方法

表达载体的构建在植物基因工程研究中占据重要地位,直接关系到目的基因的表达效果。作者在收集整理前人的工作基础上,比较分析了5种不同载体构建方法的特点,给出了不同载体构建方法的适用性建议,期望能对植物基因工程中的载体构建工作提供有益帮助。在构建多片段连接的小载体的时候推荐用一步克隆法,在构建多片段连接的复杂的大载体时采用相应的复杂载体构建技术,在已获得无选择标记的转基因植株时采用三段T-DNA构建方法构建载体。在做基因功能验证时采用的Gateway技术,非常简单的载体构建可以采用传统的酶切连接的构建方式。现在的主流构建载体方式是利用结合其他手段的Gateway技术,未来载体的发展趋势将是无酶连接。