三气培养箱校准方法的研究

三气培养箱的计量特性直接影响着细胞培养质量。为推动现代生物技术发展,本文根据其结构,分析了主要的计量参量,并探讨了相应的校准方法。结果表明:该方法具有可行性,能为有效溯源提供技术依据。

4种卵巢癌细胞缺氧模型的比较

目的通过比较两种物理和两种化学缺氧方法诱导卵巢癌细胞上皮-间质转化的效果,建立最佳缺氧诱导EMT方法。方法 SKOV3细胞经各种缺氧方法处理24小时后,倒置显微镜观察细胞形态改变,Western blot检测相关蛋白标志物及缺氧诱导因子-1α表达水平的变化。结果 厌氧培养袋及三气培养箱缺氧均能诱导SKOV3细胞形态由铺路石样的上皮细胞形态改变为明显的梭形间质细胞形态,并增高缺氧诱导因子-1α及间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin)的表达,降低上皮细胞标志物上皮型-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达,提示发生EMT现象。氯化钴(CoCl_2)及亚硫酸钠(Na_2SO_3)处理24小时后未能诱导SKOV3细胞发生EMT相关细胞形态及标志物表达变化。结论 厌氧培养袋和三气培养箱可成功诱导卵巢癌细胞发生EMT。

内皮细胞低氧复氧损伤模型的建立

目的构建人血管内皮细胞低氧复氧损伤模型,作为心肌组织慢复流的体外研究模型。方法设定三气培养箱的混合气中5%O_(2)为低氧培养条件,二氧化碳培养箱(95%空气、5%CO_(2))中的培养条件为复氧条件。将对数生长期的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)随机分为5组,分别置于三气培养箱(90%N 2、5%CO_(2)、5%O_(2))中处理不同时间(0、4、8、16及32 h)。挑选出最佳低氧处理时间后,再将随机分组的细胞进行不同时间(0、1、2、3、4、5及6 h)的复氧处理。Western blot检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)的蛋白表达;显微镜下观察细胞形态学变化;CCK-8法检测细胞存活率;酶联免疫吸附法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性以反映细胞损伤情况。结果与对照组相比,实验组HUVEC的HIF-1α蛋白表达随低氧处理时间的延长而增高(P<0.01);细胞密度在低氧处理的短时间内会适应性增加,从16 h开始降低;细胞存活率的变化趋势与细胞密度一致(P<0.01);LDH活性则在低氧4 h时升高,低氧8 h时回落,低氧16 h时又重新回升(P<0.01)。复氧后,细胞密度与细胞存活率的变化随时间呈现先降低后升高的趋势(P<0.05);LDH活性则随时间呈现先升高后降低的趋势,峰值出现于复氧3 h(P<0.01)。实验结果表明,低氧16 h为最佳低氧处理时间,复氧3 h为最佳复氧处理时间。结论本研究建立了稳定可靠的HUVEC低氧复氧损伤模型,为心肌组织缺血再灌注后慢复流的体外实验研究奠定了基础。

新生大鼠海马神经元体外氧-糖剥夺再灌注模型的建立

目的体外培养新生大鼠海马神经元,建立神经元氧-糖剥夺再灌注(OGD/R)模型,为临床进一步研究新生儿缺氧缺血性脑损伤奠定基础。方法以L-多聚赖氨酸和鼠尾胶原作为海马神经元体外培养的生长基质,分离24h内新生SD大鼠海马,胰蛋白酶水浴振荡消化获得单个细胞,采用Neurobasal维持培养基更继续培养。培养7d后将神经元细胞培养基更换为无糖缺血液,置于95%高纯度氮气(N2)三气培养箱内缺氧处理2h。将其取出更换为正常培养基继续培养24h,构建神经元OGD/R模型。然后,采用抗微管相关蛋白2-5-异硫氰酸荧光素(anti-MAP2-FITC)标记神经元,于荧光显微镜下观察建模前与建模后神经元的形态学改变,采用细胞活性检测试剂盒(CCK-8)检测微管相关蛋白(MAP)2阳性细胞存活率,对OGD/R模型进行评价。结果荧光显微镜下观察到正常情况下神经元细胞形态结构完整,树突及轴突舒展,交织成网状。建模后,神经元突触回缩,细胞崩解,网状结构被破坏。CCK-8检测结果显示,建模后神经元细胞存活率降低。结论此方法体外培养神经元细胞纯度在95%以上;使用无糖神经元细胞缺血液联合高纯度N2培养2h,再更换为正常培养基培养的方法,可成功建立神经元细胞的OGD/R模型。