TCA/丙酮沉淀对脑脊液标本中蛋白质双向电泳的影响分析

目的探讨三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀对脑脊液标本中蛋白质双向电泳结果的影响,为脑脊液标本中蛋白检测提供参考。方法采用丙酮沉淀法及TCA/丙酮沉淀法沉淀脑脊液标本中蛋白质,并进行双向电泳实验,观察两种沉淀方法蛋白双向电泳蛋白点数目及形态。结果TCA/丙酮沉淀标本后双线电泳图谱蛋白点342个,蛋白点形态呈点状、边缘清晰,丙酮沉淀标本双向电泳图谱蛋白位点276个,多呈条带状,边缘不清晰,TCA/丙酮沉淀法双向电泳图谱蛋白点数及清晰度高于丙酮沉淀法。结论TCA/丙酮沉淀法能够增加脑脊液标本蛋白沉淀效果,提高脑脊液标本中蛋白双向电泳的灵敏度。

大鼠皮质双向电泳样品制备方法的优化

目的优化大鼠皮质双向电泳样品制备方法,初步建立双向电泳条件,提高电泳分辨率和重复性。方法分别应用三氯乙酸/丙酮沉淀法、超速离心法及改良超速离心法制备电泳样品,并比较各处理方法对电泳的影响。改良超速离心法即将混合了匀浆液Ⅱ的匀浆物4℃放置过夜后再进行后续处理。结果改良超速离心法所制备的电泳样品,不仅可以减少蛋白的降解,还可以增加蛋白的溶解性,从而获得分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱。结论改良超速离心法更适于制备来源于中枢神经系统双向电泳样品。

墓头回提取物作用白血病K562细胞蛋白双向电泳方法的建立

目的建立适用于体外培养的K562细胞总蛋白的双向电泳图谱,提高电泳分辨率和重复性,以进一步了解中药墓头回作用于白血病细胞的新机制。方法采用标准裂解法提取K562细胞总蛋白,后续进行丙酮沉淀和三氯乙酸/丙酮沉淀,分别比较一步裂解法所得蛋白和丙酮沉淀法、三氯乙酸/丙酮沉淀法所得蛋白的双向电泳图谱,优选最佳的样品制备方法。此外在等电聚焦时,聚焦电压在传统聚焦条件上进行优化。结果 丙酮沉淀法不仅能减少蛋白降解,而且增加蛋白的溶解性,因此丙酮沉淀法所得蛋白的双向电泳图谱显示出更好的溶解性和重复性,在聚焦条件上对传统聚焦条件的优化使横向和纵向拖尾有明显改善,所得图谱蛋白点更清晰,分离更完全,能获得分辨率较高的双向电泳图谱。结论 在标准裂解液提取蛋白基础上结合丙酮沉淀法更适于制备K562细胞的双向电泳样品,等电聚焦(IEF)电泳时适当延长除盐时间能更有效的分离K562细胞全蛋白,而且后续实验证明此方法同样成功建立了墓头回作用白血病K562细胞蛋白和肿瘤组织蛋白2-DE图谱。

灵芝子实体原基双向电泳和总蛋白质提取方法的建立

比较了Tris-饱和酚法和三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法对灵芝子实体原基总蛋白质的提取效果。用Image Master 2D Platinum6.0软件分析两种方法所提蛋白质的双向电泳图谱,分别得到565和273个蛋白质点;(TCA)/丙酮沉淀法在碱性端低分子量区域有些蛋白质斑点存在拖尾现象,Tris-饱和酚法能有效去除样品中的盐分,使蛋白质的聚焦效果更好,蛋白点数增加。Tris-饱和酚法可做为灵芝子实体原基总蛋白质的提取方法并为其他药用真菌总蛋白质的提取提供参考,同时为本实验室后续研究灵芝双向性固体发酵雷公藤的蛋白差异表达奠定了基础。

纳升级反相液相色谱串联质谱法分析海马蛋白质组

目的:为了全面了解海龙的蛋白质成分,对其蛋白表达谱进行蛋白质组学分析。方法:应用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取海马药材的蛋白质,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析,将聚丙烯酰胺凝胶电泳条带切下进行胶内酶解处理后,应用纳升级反相液相色谱串联质谱(nano RPLC-MS/MS)法系统分析海马提取蛋白质胶内酶解产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质。结果:共鉴定到海马蛋白192种,等电点范围为4.06~12.18,相对分子质量范围为3.06×10~3~3.52×10~6,多肽10 680个;通过生物信息学方法分析了海马提取蛋白质的分子功能。得到海马提取物中的蛋白质具有结合、酶催化、肌动、ATP酶等功能活性,其中结合活性的蛋白质占的比例较大。结论:本研究建立了海马的蛋白质表达谱,可为海马药材中蛋白质的深入研究奠定基础,对海马药材有效成分的分析和海马药材鉴别具有重要意义。