三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是A群链球菌(group A Streptococcus,GAS)表面的纤溶酶原(Plg)受体之一,其C末端的赖氨酸残基可以与Plg的赖氨酸结合位点(LBS)相结合。脂蛋白(a)[Lp(a)]中的载脂蛋白(a)[Apo(a)]与Plg有很高的同源性。因此本实...三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是A群链球菌(group A Streptococcus,GAS)表面的纤溶酶原(Plg)受体之一,其C末端的赖氨酸残基可以与Plg的赖氨酸结合位点(LBS)相结合。脂蛋白(a)[Lp(a)]中的载脂蛋白(a)[Apo(a)]与Plg有很高的同源性。因此本实验室提出了Lp(a)可能与GAS表面的Plg受体相结合,进而可能竞争性抑制GAS与Plg结合的假说。本研究克隆了GAS的GAPDH及其C末端敲除赖氨酸残基的突变体基因,酶切后将其连接到表达载体pASK-IBA37中,并在大肠杆菌BL-21中表达了这两个重组蛋白(rGAPDH和rGAPDHΔ345)。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对rGAPDH和rGAPDHΔ345与Lp(a)的相互作用机制进行了研究。结果表明rGAPDHΔ345与Lp(a)的结合值比rGAPDH显著降低,说明rGAPDH及rGAPDHΔ345与Lp(a)通过LBS发生特异性结合,而且一定浓度的赖氨酸类似物6-氨基己酸(EACA)可以抑制这种结合,Lp(a)对rGAPDH与Plg的相互作用也有明显的抑制。展开更多
旨在评价斯氏艾美耳球虫重组蛋白Es-GAPDH对兔的免疫保护效果,为兔斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研制奠定基础。利用相对荧光定量PCR分析Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫不同发育时期的转录水平,并对Es-GAPDH进行原核表达与蛋白纯化;然后将4...旨在评价斯氏艾美耳球虫重组蛋白Es-GAPDH对兔的免疫保护效果,为兔斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研制奠定基础。利用相对荧光定量PCR分析Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫不同发育时期的转录水平,并对Es-GAPDH进行原核表达与蛋白纯化;然后将42只45日龄无球虫幼兔随机分为5组(空白对照组、不免疫攻虫组、Trx-His-S tag攻虫对照组、Quil-A saponin攻虫对照组和rEs-GAPDH免疫组),分别经颈部皮下注射1 mL PBS、1 mL PBS、1 mL PBS含100μg pET-32a空载蛋白含1 mg Quil-A、1 mL PBS含1 mg Quil-A、1 mL 100μg rEs-GAPDH含1 mg Quil-A,首免14 d后同等剂量加强免疫。二免14 d后除空白对照组外,其余各组实验兔经口感染1×10^(4)个斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊,攻虫后观察各组临床表现,每周定时采血、称重,感染21 d后剖检观察肝组织病理变化,并测定和统计每组的相对增重、料肉比、肝指数、卵囊排出量、生化指标、特异性IgG抗体以及细胞因子等。结果发现,Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫各个发育阶段均有转录,且转录水平存在差异,在孢子化卵囊阶段转录水平最高。免疫保护试验表明:感染后不免疫攻虫组出现兔肝球虫病典型症状,而rEs-GAPDH免疫组症状不明显。rEs-GAPDH免疫组的卵囊减少率达87.09%,相对增重率显著大于三个攻虫对照组(P<0.05),特异性IgG抗体水平、细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β)水平均与不免疫攻虫组存在显著差异(P<0.05),组织病理切片也显示,免疫组相较不免疫攻虫组肝组织被破坏程度低,虫体数量较少。综上,斯氏艾美耳球虫重组蛋白rEs-GAPDH可减少增重损失和卵囊排出,能引发宿主体内的细胞免疫和体液免疫应答,具有一定免疫保护作用,可作为斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。展开更多
Expression vector p301-bG1 contains a Sw gene and a bialaphos resistance gene both driven by glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GPD) gene promoter isolated from Lentinus edodes ( Berk.) Sing. Using p301-bG1, P...Expression vector p301-bG1 contains a Sw gene and a bialaphos resistance gene both driven by glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GPD) gene promoter isolated from Lentinus edodes ( Berk.) Sing. Using p301-bG1, PEG-mediated transformation of protoplast of L. edodes was studied. Mixed with PEG-purified plasmid DNA, the protoplasts of L. edodes were treated with PEG solution and cultured on CYM regeneration plate containing 40 mug/mL bialaphos. Bialaphos-resistant and GUS-positive transformants were obtained using this transformation system. Although the transformation efficiency was relatively low, the protocols release large expenses on expensive instrument and restriction enzymes, providing a simple and economical method for mushroom breeding at the molecular level.展开更多
文摘三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是A群链球菌(group A Streptococcus,GAS)表面的纤溶酶原(Plg)受体之一,其C末端的赖氨酸残基可以与Plg的赖氨酸结合位点(LBS)相结合。脂蛋白(a)[Lp(a)]中的载脂蛋白(a)[Apo(a)]与Plg有很高的同源性。因此本实验室提出了Lp(a)可能与GAS表面的Plg受体相结合,进而可能竞争性抑制GAS与Plg结合的假说。本研究克隆了GAS的GAPDH及其C末端敲除赖氨酸残基的突变体基因,酶切后将其连接到表达载体pASK-IBA37中,并在大肠杆菌BL-21中表达了这两个重组蛋白(rGAPDH和rGAPDHΔ345)。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对rGAPDH和rGAPDHΔ345与Lp(a)的相互作用机制进行了研究。结果表明rGAPDHΔ345与Lp(a)的结合值比rGAPDH显著降低,说明rGAPDH及rGAPDHΔ345与Lp(a)通过LBS发生特异性结合,而且一定浓度的赖氨酸类似物6-氨基己酸(EACA)可以抑制这种结合,Lp(a)对rGAPDH与Plg的相互作用也有明显的抑制。
文摘旨在评价斯氏艾美耳球虫重组蛋白Es-GAPDH对兔的免疫保护效果,为兔斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研制奠定基础。利用相对荧光定量PCR分析Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫不同发育时期的转录水平,并对Es-GAPDH进行原核表达与蛋白纯化;然后将42只45日龄无球虫幼兔随机分为5组(空白对照组、不免疫攻虫组、Trx-His-S tag攻虫对照组、Quil-A saponin攻虫对照组和rEs-GAPDH免疫组),分别经颈部皮下注射1 mL PBS、1 mL PBS、1 mL PBS含100μg pET-32a空载蛋白含1 mg Quil-A、1 mL PBS含1 mg Quil-A、1 mL 100μg rEs-GAPDH含1 mg Quil-A,首免14 d后同等剂量加强免疫。二免14 d后除空白对照组外,其余各组实验兔经口感染1×10^(4)个斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊,攻虫后观察各组临床表现,每周定时采血、称重,感染21 d后剖检观察肝组织病理变化,并测定和统计每组的相对增重、料肉比、肝指数、卵囊排出量、生化指标、特异性IgG抗体以及细胞因子等。结果发现,Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫各个发育阶段均有转录,且转录水平存在差异,在孢子化卵囊阶段转录水平最高。免疫保护试验表明:感染后不免疫攻虫组出现兔肝球虫病典型症状,而rEs-GAPDH免疫组症状不明显。rEs-GAPDH免疫组的卵囊减少率达87.09%,相对增重率显著大于三个攻虫对照组(P<0.05),特异性IgG抗体水平、细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β)水平均与不免疫攻虫组存在显著差异(P<0.05),组织病理切片也显示,免疫组相较不免疫攻虫组肝组织被破坏程度低,虫体数量较少。综上,斯氏艾美耳球虫重组蛋白rEs-GAPDH可减少增重损失和卵囊排出,能引发宿主体内的细胞免疫和体液免疫应答,具有一定免疫保护作用,可作为斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。
文摘Expression vector p301-bG1 contains a Sw gene and a bialaphos resistance gene both driven by glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GPD) gene promoter isolated from Lentinus edodes ( Berk.) Sing. Using p301-bG1, PEG-mediated transformation of protoplast of L. edodes was studied. Mixed with PEG-purified plasmid DNA, the protoplasts of L. edodes were treated with PEG solution and cultured on CYM regeneration plate containing 40 mug/mL bialaphos. Bialaphos-resistant and GUS-positive transformants were obtained using this transformation system. Although the transformation efficiency was relatively low, the protocols release large expenses on expensive instrument and restriction enzymes, providing a simple and economical method for mushroom breeding at the molecular level.
