斯氏艾美耳球虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白对兔的免疫保护效果评价

旨在评价斯氏艾美耳球虫重组蛋白Es-GAPDH对兔的免疫保护效果,为兔斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研制奠定基础。利用相对荧光定量PCR分析Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫不同发育时期的转录水平,并对Es-GAPDH进行原核表达与蛋白纯化;然后将42只45日龄无球虫幼兔随机分为5组(空白对照组、不免疫攻虫组、Trx-His-S tag攻虫对照组、Quil-A saponin攻虫对照组和rEs-GAPDH免疫组),分别经颈部皮下注射1 mL PBS、1 mL PBS、1 mL PBS含100μg pET-32a空载蛋白含1 mg Quil-A、1 mL PBS含1 mg Quil-A、1 mL 100μg rEs-GAPDH含1 mg Quil-A,首免14 d后同等剂量加强免疫。二免14 d后除空白对照组外,其余各组实验兔经口感染1×10^(4)个斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊,攻虫后观察各组临床表现,每周定时采血、称重,感染21 d后剖检观察肝组织病理变化,并测定和统计每组的相对增重、料肉比、肝指数、卵囊排出量、生化指标、特异性IgG抗体以及细胞因子等。结果发现,Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫各个发育阶段均有转录,且转录水平存在差异,在孢子化卵囊阶段转录水平最高。免疫保护试验表明:感染后不免疫攻虫组出现兔肝球虫病典型症状,而rEs-GAPDH免疫组症状不明显。rEs-GAPDH免疫组的卵囊减少率达87.09%,相对增重率显著大于三个攻虫对照组(P<0.05),特异性IgG抗体水平、细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β)水平均与不免疫攻虫组存在显著差异(P<0.05),组织病理切片也显示,免疫组相较不免疫攻虫组肝组织被破坏程度低,虫体数量较少。综上,斯氏艾美耳球虫重组蛋白rEs-GAPDH可减少增重损失和卵囊排出,能引发宿主体内的细胞免疫和体液免疫应答,具有一定免疫保护作用,可作为斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。

日本血吸虫三磷酸甘油醛脱氢酶核酸疫苗小鼠体内的免疫应答特征

目的研究日本血吸虫大陆株三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠诱生的免疫应答特征和保护性。方法将用免疫筛库得到的日本血吸虫大陆株GAPDH编码基因以PCR扩增,扩增产物T-A克隆至载体pT-Adv而后与真核表达载体pcDNA3连接,构建成核酸疫苗(pcDNA3-SjGAPDH)。将纯化的pcDNA3-SjGAPDH经后腿胫前肌免疫C57BL/6小鼠。免疫荧光染色法研究pcDNA3-SjGAPDH在注射的局部肌肉表达特性;用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Westernblotting)、ELISA等方法分析pcDNA3-SjGAPDH所诱导的特异性免疫应答特征。结果pcDNA3-SjGAPDH免疫后24和48h即可在荧光显微镜下看到C57BL/6小鼠小腿胫前肌的局部肌肉的冰冻切片发出淡绿色荧光,表明有GAPDH蛋白的表达。pcDNA3-SjGAPDH免疫小鼠主要诱生IgG2a、IgG2b和IgG3亚类;免疫小鼠脾淋巴细胞体外经特异性抗原刺激主要诱生γ-干扰素(IFN-γ)和白介素-2(IL-2)细胞因子,未检出IL-4。另外,免疫鼠血清能够识别日本血吸虫SWAP中的天然GAPDH成分。结论pcDNA3-SjGAPDH核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠主要诱导Th1类型细胞免疫应答。

菊苣提取物对雌性鹌鹑高尿酸血症模型胰岛素抵抗和雌二醇、三磷酸甘油醛脱氢酶的影响

目的以胰岛素抵抗(IR)、雌二醇(E2)、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为观察指标,探讨菊苣提取物降尿酸的机理。方法鹌鹑按体质量随机分为5组:正常组、模型组、阳性药组及菊苣提取物大、小剂量组,每组15只。正常组给予普通饲料,其余各组均予以造模饲料,同时各给药组予相应药物干预,连续给药28 d。检测血清尿酸(UA)、胰岛素(Ins)、E2水平及全血GAPDH活性,并计算胰岛素抵抗指数(ISI)。结果与正常组比较,用药28 d期间模型组UA水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,菊苣提取物各剂量组UA水平显著降低(P<0.05)。各组比较Ins、ISI均未见显著变化(P>0.05)。与正常组比较,模型组E2水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,菊苣提取物大剂量组E2显著升高(P<0.05)。与正常组比较,模型组GAPDH显著降低(P<0.05),各给药组GAPDH显著升高(P<0.05)。结论菊苣提取物降尿酸的机理可能一方面通过直接升高E2水平促进UA排泄,另一方面还与其升高E2水平,使GAPDH间接升高有关。此外,菊苣提取物还可通过直接升高GAPDH活性降低UA水平。

细粒棘球绦虫三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达及其分子特征的生物信息学分析

三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中的关键酶,现已发现该酶可作为一些寄生虫的疫苗候选分子和药物靶标。然而,有关绦虫三磷酸甘油醛脱氢酶的研究报道较少。为探究细粒棘球绦虫GAPDH(EgGAPDH)的分子特征与应用价值,克隆细粒棘球绦虫的GAPDH基因,并以生物信息学方法对其进行系统的分析。结果显示:EgGAPDH基因全长1 011bp,编码336个氨基酸。EgGAPDH是由4个结构相同的单体蛋白(O、P、Q、R)组成的一个同源四聚体,每个单体蛋白质含有3个活性中心,即NAD+绑定区域(aa 4-151和aa 315-336)、催化结合区域(aa 156-314)和一个酶活性位点(aa 149-156)。通过对EgGAPDH的氨基酸序列的抗原表位预测得到了16个B细胞抗原表位和9个T细胞结合位点;Western blot显示原核表达的重组EgGAPDH能与感染细粒棘球蚴的小鼠血清发生特异性结合;以纯化的重组EgGAPDH蛋白为抗原通过ELISA法检测17份细粒棘球蚴小鼠阳性血清,阳性检出率为100%。试验结果表明:成功克隆并表达细粒棘球绦虫的EgGAPDH基因,EgGAPDH蛋白具有3个酶功能区域和多个免疫结合位点,Western blot和ELISA结果显示,该蛋白质可能具有作为抗细粒棘球蚴的药物靶标和疫苗候选分子的潜力。

黑曲霉(ASPERGILLUS NIGER)SG株三磷酸甘油醛脱氢酶基因的分离与初步鉴定

黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒ）在工业生产和科学研究中占有重要地位，因为许多黑曲霉菌株能产生有机酸和酶制剂，并能分泌大量蛋白质到细胞外［１，６］．三磷酸甘油醛脱氢酶（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａ...

肺炎链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH与热休克蛋白DnaJ的相互作用

目的验证肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)糖酵解关键酶三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和热休克蛋白Dna J的相互作用。方法 PCR扩增S.pn D39 GAPDH蛋白编码基因gap全长,将其克隆至p ET-28a(+),重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导GAPDH-6His的表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE鉴定其纯度。重组GAPDH蛋白经腹部皮下免疫昆明小鼠获得多克隆抗体。Western blot鉴定GAPDH的保守性。采用大肠杆菌双杂交系统、直接结合实验、生物膜层干涉技术(Bio-layer Interferometry,BLI)验证GAPDH和Dna J的相互作用。结果获得了纯度达90%的GAPDH重组蛋白,并获得了效价达107的抗GAPDH多克隆抗体,Western blot检测显示在7株不同血清型S.pn的全菌裂解液和培养上清中均存在和抗GAPDH抗体反应的特异性条带。大肠杆菌双杂交系统显示GAPDH和Dna J共转化菌株能够在3-AT平板及双选择培养平板上生长,提示二者在细菌胞内有相互作用。直接结合实验和BLI显示随着加入GAPDH蛋白浓度的增加,二者的结合量也增加,提示GAPDH和Dna J的结合具有浓度依赖性。BLI实验也显示GAPDH和Dna J的亲和常数为1.12×10-7mol/L。结论糖酵解关键酶GAPDH在肺炎链球菌中保守表达,且为分泌性蛋白;该蛋白和热休克蛋白Dna J在细胞内存在相互作用,且为直接相互作用。

链球菌表面三磷酸甘油醛脱氢酶及其突变体重组蛋白的表达和纯化

表达并纯化M6型GAS表面三磷酸甘油醛脱氢酶以及其敲除C末端赖氨酸残基重组蛋白(rGAPDH和rGAPDHΔ345)。克隆了M6型GAS ATCC32175的GAPDH基因以及GAPDHΔ345基因,与pASK-IBA37载体连接后,表达蛋白并用亲和层析色谱纯化重组蛋白;对重组蛋白进行质谱检测,并用酶切方法进一步纯化目的蛋白,通过酶促反应实验测定了重组蛋白的生物活性。2种基因克隆条件稳定,蛋白表达量大,酶切后纯度高,纯化的重组蛋白具有较高的生物活性。功表达并纯化了rGAPDH和rGAPDHΔ345蛋白。

黄伞菌株中三磷酸甘油醛脱氢酶基因片段的分离鉴定与保守性验证

本研究以黄伞菌丝cDNA为模板,设计简并引物,经PCR扩增出两条片段SL1和SL2,经过回收、重扩增、克隆与鉴定后进行测序分析,结果发现SL1的序列在Genebank中与三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease,GPD)基因的同源性达到85%,根据SL1序列设计引物,以黄伞菌丝体、原基、菇蕾、子实体菌柄、子实体菌盖的cDNA为模板进行PCR反应以验证其保守性,结果显示此片段在不同分化发育阶段表达量相同。

利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子

【目的】克隆产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD的启动子(PCggpd),并通过报告基因gfp的差异表达来研究葡萄糖浓度对PCggpd在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的诱导特性。【方法】采用PCR扩增的方法分别从产甘油假丝酵母基因组和pCAMBIA1302载体中克隆出CgGPD的启动序列PCggpd和绿色荧光蛋白基因gfp。将两个基因同时构建到酿酒酵母表达载体pYX212-zeocin中,构建时将绿色荧光蛋白基因gfp置于CgGPD的启动序列下游,获得重组质粒pYX212-zeocin-PCggpd-gfp。通过电击转化酿酒酵母W303-1A。将重组酿酒酵母S.cerevisiae W303-1A-GFP置于不同葡萄糖浓度培养基中进行培养,利用荧光显微技术对其进行荧光检测。【结果】重组酿酒酵母能产生稳定的荧光,当葡萄糖浓度为2%时,重组酿酒酵母在YEPD培养基中产生较弱的荧光,随着葡萄糖浓度的升高,荧光强度有明显的增强。【结论】PCggpd属于环境胁迫诱导型启动子,高浓度的葡萄糖能诱导PCggpd启动绿色荧光蛋白的高水平表达,这对完善产甘油假丝酵母的遗传背景研究,阐明其高产甘油的机理具有重要意义。

重组A群链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶与脂蛋白(a)的相互作用

三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是A群链球菌(group A Streptococcus,GAS)表面的纤溶酶原(Plg)受体之一,其C末端的赖氨酸残基可以与Plg的赖氨酸结合位点(LBS)相结合。脂蛋白(a)[Lp(a)]中的载脂蛋白(a)[Apo(a)]与Plg有很高的同源性。因此本实验室提出了Lp(a)可能与GAS表面的Plg受体相结合,进而可能竞争性抑制GAS与Plg结合的假说。本研究克隆了GAS的GAPDH及其C末端敲除赖氨酸残基的突变体基因,酶切后将其连接到表达载体pASK-IBA37中,并在大肠杆菌BL-21中表达了这两个重组蛋白(rGAPDH和rGAPDHΔ345)。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对rGAPDH和rGAPDHΔ345与Lp(a)的相互作用机制进行了研究。结果表明rGAPDHΔ345与Lp(a)的结合值比rGAPDH显著降低,说明rGAPDH及rGAPDHΔ345与Lp(a)通过LBS发生特异性结合,而且一定浓度的赖氨酸类似物6-氨基己酸(EACA)可以抑制这种结合,Lp(a)对rGAPDH与Plg的相互作用也有明显的抑制。

嗜酸乳杆菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的分离纯化

目的分离纯化嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 4356的3-磷酸甘油醛脱氢酶。方法利用硫酸铵分级沉淀法、亲和层析、阴离子交换和分子筛层析对嗜酸乳杆菌GAPDH进行了分离纯化。通过N端测序鉴定了纯化产物;并用分子筛测定了嗜酸乳杆菌GAPDH的相对分子质量(Mr)。结果纯化产物在SDS-PAGE胶上呈现Mr为3.7×104的单一条带,产量为0.9 mg/L(嗜酸乳杆菌培养物)。N端测序结果证明纯化产物为嗜酸乳杆菌GAPDH。分子筛测定的GAPDH的Mr为7.08×104,表明嗜酸乳杆菌GAPDH是二聚体。结论通过该纯化方案,可大量获得电泳纯的嗜酸乳杆菌GAPDH,为进一步研究其免疫功能以及开发为免疫促进剂打下了基础。

谷子3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与结构分析

3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)在谷子盐旱胁迫早期高频率表达,为研究该基因在胁迫反应及其他代谢中的详细功能,本研究利用RACE技术克隆了谷子的GAPDH基因。该基因cDNA全长1 328 bp,包括1 008 bp的开放阅读框,共编码338个氨基酸,肽段的分子量为35 911.03 Da,极性氨基酸占29.12%。序列比较分析发现,谷子的GAPDH同玉米的同源序列表现了最高的相似性,同水稻和小麦同源序列的相似性次之,同双子叶植物的同源序列则相差较远。

植物3-磷酸甘油醛脱氢酶的多维本质(英文)

3-磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH 作为一种糖酵解蛋白在糖酵解的能量产生中发挥着重要作用 .它通常作为一种模式蛋白用于蛋白和酶的分析 ,也可以用作研究基因表达量的内在对照 .然而 ,最近的相关研究表明 ,真核及原核生物的 3-磷酸甘油醛脱氢酶实际上存在着一种多维本质 ,研究证明它在 DNA修复、细胞凋亡、核 RNA输出、及其在细胞周期中都发挥着重要的作用 .尽管该酶在植物中的研究不如在哺乳动物中的深入 ,但研究已经陆续证明 ,3-磷酸甘油醛脱氢酶在植物中同样具有许多未被发现的功能 ,目前已经报道该酶在厌氧、热激、伤害以及能量供应中可能发挥着重要作用 .本文旨在就国内外对于该酶在植物中的研究作一总结论述 ,以期推进科学界对它的更深入认识和研究 .

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.

稻瘟病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及序列分析

以PCR为基础结合cDNA文库构建，分两段克隆稻瘟病菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（gpd），分别测序、合并，获得该基因编码区全部1011bp的核苷酸序列，可以编码336个氨基酸和1个终止密码子TAA。该序列与其它12种丝状真菌的已知gpd基因序列有着高度的同源性。它们的核苷酸序列同源性为61．4％～86．6％，氨基酸序列同源性为64．6％～863％。尤其在酶的活性功能区，不同丝状真菌间有着近100％的同源性。稻瘟病菌gpd基因密码子的使用具有明显的偏向性。

日本血吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶的克隆 表达及结构预测

目的 克隆、表达日本血吸虫（大陆株）3-磷酸甘油醛脱氢酶（SjcGAPDH）编码基因并作结构预测。方法 将编码SjeGAPDH的pBlueseript质粒用限制性内切酶XhoⅠ和SacⅠ消化后，收集目的片段，与经同样酶切的原核表达载体pET28b连接，筛选重组克隆并测序，将正确的重组质粒转化入BL21（DE3）感受态细菌，异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白。用GeneRunner软件对该蛋白的结构及抗原表位进行预测。结果 十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）观察到大小约42．7kDa的特异性蛋白条带，与预计一致。免疫印迹试验（Western blot）结果表明致弱尾蚴免疫兔血清可识别该重组蛋白。结构预测表明SjcGAPDH的第50～70、102～122、135～148、165～175、187-205、254-272、278-285位氨基酸区域可能为蛋白质的抗原优势区域。结论 SjcGAPDH编码基因克隆、表达获得成功，为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础，对GAPDH的结构和性质预测为探索该蛋白的抗原优势表位提供了理论依据。

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白的纯化、酶学活性及免疫学研究

目的体外制备华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白(CsGAPDH),分析其酶学活性及免疫学特性。方法常规表达重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),用凝血酶和纯化柱酶切、纯化的CsGAPDH免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。ELISA检测抗IgG抗体滴度,浓缩型S-P免疫组化3步法检测CsGAPDH抗原在免疫小鼠体内的分布和表达。蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其抗血清的特异性。建立酶反应体系测定重组蛋白CsGAPDH的酶催化活性。结果纯化蛋白样品呈单一条带。免疫动物获取CsGAPDH抗血清,在免疫过程中抗体滴度呈连续上升趋势。CsGAPDH抗原分布和表达于小鼠肌细胞膜部位。免疫小鼠血清具有抗CsGAPDH特异性抗体。重组蛋白CsGAPDH具有酶生理活性,其酶活力单位为2 872 U min-1.ml-1。结论制备的重组蛋白CsGAPD H具有较好的酶活性和免疫原性。

马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测

根据GenBank中马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(BmG3PD基因)序列设计引物,以马来丝虫mRNA为模板,RT-PCR扩增BmG3PD基因,将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及PCR鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmG3PD,经序列分析及同源性比较,以及对其编码产物进行B细胞表位预测,结果表明PCR扩增的特异性条带为1020bp,与预期相符,与GenBank已知基因序列同源性为99%。编码产物B细胞表位预测,氨基酸区域可能在22～36、242～255、303～318和326～336位。

青海湖裸鲤三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆和表达特性

目的开展青海湖裸鲤基础生物学特征和适应低氧、低温、高盐度的分子机理的研究,揭示青海湖裸鲤的基本生命活动规律,为该鱼种的资源保护和人工增殖放流提供理论依据。方法通过RT-PCR和RACE技术,得到了青海湖裸鲤三磷酸甘油醛脱氢酶(Gp-GAPDH)两种旁系同源体的完整编码序列,分别命名为Gp-GAPDHα(JX287372)和Gp-GAPDHβ(JX287373)。通过半定量RT-PCR分析Gp-GAPDHα和Gp-GAPDHβ在不同的组织和胚胎发育不同阶段的表达量。结果 Gp-GAPDH两种异形体蛋白质序列的同源性为72%,所编码的氨基酸序列与其他物种具有较高的相似度。两种旁系同源体基因在不同组织和胚胎发育不同阶段表达水平各有所不同,其中Gp-GAPDHα在胚胎发育不同阶段的表达量存在极为显著的差异。结论在青海湖裸鲤胚胎发育研究中,Gp-GAPDHα不适合作为参照基因使用,两者的功能则需要做进一步研究。