黄伞菌株中三磷酸甘油醛脱氢酶基因片段的分离鉴定与保守性验证

本研究以黄伞菌丝cDNA为模板,设计简并引物,经PCR扩增出两条片段SL1和SL2,经过回收、重扩增、克隆与鉴定后进行测序分析,结果发现SL1的序列在Genebank中与三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease,GPD)基因的同源性达到85%,根据SL1序列设计引物,以黄伞菌丝体、原基、菇蕾、子实体菌柄、子实体菌盖的cDNA为模板进行PCR反应以验证其保守性,结果显示此片段在不同分化发育阶段表达量相同。

黑曲霉(ASPERGILLUS NIGER)SG株三磷酸甘油醛脱氢酶基因的分离与初步鉴定

黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒ）在工业生产和科学研究中占有重要地位，因为许多黑曲霉菌株能产生有机酸和酶制剂，并能分泌大量蛋白质到细胞外［１，６］．三磷酸甘油醛脱氢酶（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａ...

细粒棘球绦虫三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达及其分子特征的生物信息学分析

三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中的关键酶,现已发现该酶可作为一些寄生虫的疫苗候选分子和药物靶标。然而,有关绦虫三磷酸甘油醛脱氢酶的研究报道较少。为探究细粒棘球绦虫GAPDH(EgGAPDH)的分子特征与应用价值,克隆细粒棘球绦虫的GAPDH基因,并以生物信息学方法对其进行系统的分析。结果显示:EgGAPDH基因全长1 011bp,编码336个氨基酸。EgGAPDH是由4个结构相同的单体蛋白(O、P、Q、R)组成的一个同源四聚体,每个单体蛋白质含有3个活性中心,即NAD+绑定区域(aa 4-151和aa 315-336)、催化结合区域(aa 156-314)和一个酶活性位点(aa 149-156)。通过对EgGAPDH的氨基酸序列的抗原表位预测得到了16个B细胞抗原表位和9个T细胞结合位点;Western blot显示原核表达的重组EgGAPDH能与感染细粒棘球蚴的小鼠血清发生特异性结合;以纯化的重组EgGAPDH蛋白为抗原通过ELISA法检测17份细粒棘球蚴小鼠阳性血清,阳性检出率为100%。试验结果表明:成功克隆并表达细粒棘球绦虫的EgGAPDH基因,EgGAPDH蛋白具有3个酶功能区域和多个免疫结合位点,Western blot和ELISA结果显示,该蛋白质可能具有作为抗细粒棘球蚴的药物靶标和疫苗候选分子的潜力。

青海湖裸鲤三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆和表达特性

目的开展青海湖裸鲤基础生物学特征和适应低氧、低温、高盐度的分子机理的研究,揭示青海湖裸鲤的基本生命活动规律,为该鱼种的资源保护和人工增殖放流提供理论依据。方法通过RT-PCR和RACE技术,得到了青海湖裸鲤三磷酸甘油醛脱氢酶(Gp-GAPDH)两种旁系同源体的完整编码序列,分别命名为Gp-GAPDHα(JX287372)和Gp-GAPDHβ(JX287373)。通过半定量RT-PCR分析Gp-GAPDHα和Gp-GAPDHβ在不同的组织和胚胎发育不同阶段的表达量。结果 Gp-GAPDH两种异形体蛋白质序列的同源性为72%,所编码的氨基酸序列与其他物种具有较高的相似度。两种旁系同源体基因在不同组织和胚胎发育不同阶段表达水平各有所不同,其中Gp-GAPDHα在胚胎发育不同阶段的表达量存在极为显著的差异。结论在青海湖裸鲤胚胎发育研究中,Gp-GAPDHα不适合作为参照基因使用,两者的功能则需要做进一步研究。

禾谷镰刀菌醛脱氢酶(ALDH)基因敲除突变体的转录组分析

【目的】对野生型PH-1菌株和醛脱氢酶(ALDH)基因FGSG_04194敲除突变体(ΔFg04194)进行转录组测序,分析禾谷镰刀菌ALDH调控菌丝生长和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)生成情况,为深入探究禾谷镰刀菌ALDH的生物学功能、DON生成机制及致病机理提供了理论依据。【方法】接种禾谷镰刀菌野生型PH-1、ΔFg04194突变体和基因回补突变体(ΔFg04194-C)菌株至CM培养基和小麦基质中,分析FGSG_04194基因对菌丝生长和DON生成的影响。利用高通量转录组测序技术对野生型PH-1菌株和ΔFg04194突变菌株在CM培养基中培养72 h的菌丝进行转录组测序,对筛选出的差异表达基因(DEGs)进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,利用实时荧光定量PCR对转录组测序结果进行验证。【结果】ΔFg04194突变体的菌落直径和生成的DON含量较野生型PH-1和ΔFg04194-C突变体菌株显著减少(P<0.05,下同)。野生型PH-1和ΔFg04194突变体转录组原始数据经过滤后获得34.9 Gb Clean data,共鉴定出329个DEGs,其中263个基因表达显著上调,66个基因表达显著下调。GO功能注释结果显示,DEGs显著富集在质膜成分、碳水化合物代谢和物质转运过程等条目上。KEGG信号通路富集分析显示,DEGs显著富集在碳水化合物代谢通路、氨基酸代谢通路、脂质代谢、能量代谢、生物降解代谢通路、细胞生长和死亡相关途径、信号转导途径等。将FGSG_04194基因调控下有代表性的DEGs分成五大类:几丁质合成相关的基因、跨膜转运蛋白相关的基因、转录因子相关基因、脂质代谢相关基因和能量代谢相关的基因。ΔFg04194突变体的ATP含量显著高于野生型PH-1和ΔFg04194-C突变体。运用实时荧光定量PCR检测7个DEGs的表达情况,其结果与转录组测序结果基本一致。【结论】FGSG_04194影响禾谷镰刀菌的菌丝生长和DON生成,并在ATP生成中起负调控作用,其机制可能与调控转录因子的表达、调控脂类代谢、氨基酸代谢和能量代谢等通路有关。

斯氏艾美耳球虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白对兔的免疫保护效果评价

旨在评价斯氏艾美耳球虫重组蛋白Es-GAPDH对兔的免疫保护效果,为兔斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研制奠定基础。利用相对荧光定量PCR分析Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫不同发育时期的转录水平,并对Es-GAPDH进行原核表达与蛋白纯化;然后将42只45日龄无球虫幼兔随机分为5组(空白对照组、不免疫攻虫组、Trx-His-S tag攻虫对照组、Quil-A saponin攻虫对照组和rEs-GAPDH免疫组),分别经颈部皮下注射1 mL PBS、1 mL PBS、1 mL PBS含100μg pET-32a空载蛋白含1 mg Quil-A、1 mL PBS含1 mg Quil-A、1 mL 100μg rEs-GAPDH含1 mg Quil-A,首免14 d后同等剂量加强免疫。二免14 d后除空白对照组外,其余各组实验兔经口感染1×10^(4)个斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊,攻虫后观察各组临床表现,每周定时采血、称重,感染21 d后剖检观察肝组织病理变化,并测定和统计每组的相对增重、料肉比、肝指数、卵囊排出量、生化指标、特异性IgG抗体以及细胞因子等。结果发现,Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫各个发育阶段均有转录,且转录水平存在差异,在孢子化卵囊阶段转录水平最高。免疫保护试验表明:感染后不免疫攻虫组出现兔肝球虫病典型症状,而rEs-GAPDH免疫组症状不明显。rEs-GAPDH免疫组的卵囊减少率达87.09%,相对增重率显著大于三个攻虫对照组(P<0.05),特异性IgG抗体水平、细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β)水平均与不免疫攻虫组存在显著差异(P<0.05),组织病理切片也显示,免疫组相较不免疫攻虫组肝组织被破坏程度低,虫体数量较少。综上,斯氏艾美耳球虫重组蛋白rEs-GAPDH可减少增重损失和卵囊排出,能引发宿主体内的细胞免疫和体液免疫应答,具有一定免疫保护作用,可作为斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。

日本血吸虫三磷酸甘油醛脱氢酶核酸疫苗小鼠体内的免疫应答特征

目的研究日本血吸虫大陆株三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠诱生的免疫应答特征和保护性。方法将用免疫筛库得到的日本血吸虫大陆株GAPDH编码基因以PCR扩增,扩增产物T-A克隆至载体pT-Adv而后与真核表达载体pcDNA3连接,构建成核酸疫苗(pcDNA3-SjGAPDH)。将纯化的pcDNA3-SjGAPDH经后腿胫前肌免疫C57BL/6小鼠。免疫荧光染色法研究pcDNA3-SjGAPDH在注射的局部肌肉表达特性;用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Westernblotting)、ELISA等方法分析pcDNA3-SjGAPDH所诱导的特异性免疫应答特征。结果pcDNA3-SjGAPDH免疫后24和48h即可在荧光显微镜下看到C57BL/6小鼠小腿胫前肌的局部肌肉的冰冻切片发出淡绿色荧光,表明有GAPDH蛋白的表达。pcDNA3-SjGAPDH免疫小鼠主要诱生IgG2a、IgG2b和IgG3亚类;免疫小鼠脾淋巴细胞体外经特异性抗原刺激主要诱生γ-干扰素(IFN-γ)和白介素-2(IL-2)细胞因子,未检出IL-4。另外,免疫鼠血清能够识别日本血吸虫SWAP中的天然GAPDH成分。结论pcDNA3-SjGAPDH核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠主要诱导Th1类型细胞免疫应答。

谷子3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与结构分析

3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)在谷子盐旱胁迫早期高频率表达,为研究该基因在胁迫反应及其他代谢中的详细功能,本研究利用RACE技术克隆了谷子的GAPDH基因。该基因cDNA全长1 328 bp,包括1 008 bp的开放阅读框,共编码338个氨基酸,肽段的分子量为35 911.03 Da,极性氨基酸占29.12%。序列比较分析发现,谷子的GAPDH同玉米的同源序列表现了最高的相似性,同水稻和小麦同源序列的相似性次之,同双子叶植物的同源序列则相差较远。

菊苣提取物对雌性鹌鹑高尿酸血症模型胰岛素抵抗和雌二醇、三磷酸甘油醛脱氢酶的影响

目的以胰岛素抵抗(IR)、雌二醇(E2)、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为观察指标,探讨菊苣提取物降尿酸的机理。方法鹌鹑按体质量随机分为5组:正常组、模型组、阳性药组及菊苣提取物大、小剂量组,每组15只。正常组给予普通饲料,其余各组均予以造模饲料,同时各给药组予相应药物干预,连续给药28 d。检测血清尿酸(UA)、胰岛素(Ins)、E2水平及全血GAPDH活性,并计算胰岛素抵抗指数(ISI)。结果与正常组比较,用药28 d期间模型组UA水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,菊苣提取物各剂量组UA水平显著降低(P<0.05)。各组比较Ins、ISI均未见显著变化(P>0.05)。与正常组比较,模型组E2水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,菊苣提取物大剂量组E2显著升高(P<0.05)。与正常组比较,模型组GAPDH显著降低(P<0.05),各给药组GAPDH显著升高(P<0.05)。结论菊苣提取物降尿酸的机理可能一方面通过直接升高E2水平促进UA排泄,另一方面还与其升高E2水平,使GAPDH间接升高有关。此外,菊苣提取物还可通过直接升高GAPDH活性降低UA水平。

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.

稻瘟病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及序列分析

以PCR为基础结合cDNA文库构建，分两段克隆稻瘟病菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（gpd），分别测序、合并，获得该基因编码区全部1011bp的核苷酸序列，可以编码336个氨基酸和1个终止密码子TAA。该序列与其它12种丝状真菌的已知gpd基因序列有着高度的同源性。它们的核苷酸序列同源性为61．4％～86．6％，氨基酸序列同源性为64．6％～863％。尤其在酶的活性功能区，不同丝状真菌间有着近100％的同源性。稻瘟病菌gpd基因密码子的使用具有明显的偏向性。

马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测

根据GenBank中马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(BmG3PD基因)序列设计引物,以马来丝虫mRNA为模板,RT-PCR扩增BmG3PD基因,将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及PCR鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmG3PD,经序列分析及同源性比较,以及对其编码产物进行B细胞表位预测,结果表明PCR扩增的特异性条带为1020bp,与预期相符,与GenBank已知基因序列同源性为99%。编码产物B细胞表位预测,氨基酸区域可能在22～36、242～255、303～318和326～336位。

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

目的 通过筛选华支睾吸虫成虫 cDNA质粒文库,寻找、识别新基因,并将其编码区克隆到原核表达质粒pGEX 4T 1中,表达出融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础。 方法 用文库通用引物对华支睾吸虫 cDNA 质粒文库进行PCR扩增,对产物为500 bp以上的质粒进行测序,测序结果在NCBI 和ExPasy 网站上进行序列分析,识别华支睾吸虫新基因,并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行开放阅读框、进化树及结构域分析。根据 pGEX 4T 1上的多克隆位点及所发现的新基因cDNA 编码序列设计引物,进行PCR 扩增,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1 上。构建的重组表达质粒经 PCR、双酶切及测序鉴定,并对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS PAGE电泳鉴定。 结果 发现CsGAPDH基因,完整阅读框含1 017 个碱基对,编码339 个氨基酸,理论分子质量单位为37.024 09 ku ,理论pI为6.66 。序列分析显示,CsGAPDH与曼氏血吸虫GAPDH的同源性为78%,具有GAPDH保守功能域。所构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS PAGE电泳显示表达产物在63 ku处有1条特异性条带。 结论 发现华支睾吸虫 GAPDH基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。

牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),并将其置于大肠杆菌中作融合表达。方法利用PCR技术,克隆GAPDH,插入克隆载体pMD18-T中得到克隆重组子pMD18-T-GAPDH。克隆重组子与表达载体pET-32a双酶切后连接构建表达质粒pET-32a-GAPDH。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果核酸序列测定与分析表明:表达重组子pET-32a-GAPDH与NCBI核酸数据库中收录的GAPDH序列同源性达99.802%;在最佳浓度的IPTG诱导下,GAPDH可高效表达。结论本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌GAPDH基因,并在大肠杆菌中表达了GAPDH蛋白,为后续实验研究GAPDH的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。

美洲大蠊3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达

旨在通过5'-RACE获得美洲大蠊3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,为进一步研究其功能奠定基础。通过3'-RACE技术,PCR扩增获取编码美洲大蠊GAPDH蛋白的全长cDNA序列;采用生物信息学方法推导出该序列编码的氨基酸序列及其理化性质;预测信号肽、蛋白疏水性、可溶性、跨膜区结构、二级结构、三级结构,并构建系统发育树;构建原核表达载体pET28a-GAPDH,IPTG诱导重组蛋白表达,并用His-tag抗体Western blotting验证。结果显示,美洲大蠊GAPDH基因,其完整阅读框含999个碱基,编码332个氨基酸。序列分析显示,该蛋白与家蚕GAPDH相似性为89%,具有GAPDH保守功能域,经IPTG诱导获得重组蛋白。

白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达

目的构建白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氧酶(GAPDH)的表达载体并使其在大肠杆菌中正确表达。方法提取基因组总RNA,PCR方法获得GAPDH基因,构建其原核表达质粒pET-32a(+)-GAPDH,转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导产生蛋白,用SDS-PAGE和Western Blotting检测GAPDH蛋白表达情况。结果构建的白色念珠菌GAPDH基因表达质粒经序列测定证实,与GenBank数据完全一致。双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入pET-32a(+)载体。在1.0 mmol·L-1的IPTG浓度诱导下表达,可观察到相对分子量51kDa的蛋白,经SDSPAGE和Western Blotting检测证实为GAPDH蛋白。结论实验成功克隆白色念珠菌GAPDH基因,并在大肠杆菌中正确表达,为白色念珠菌感染的候选疫苗奠定工作基础。

肺炎链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH与热休克蛋白DnaJ的相互作用

目的验证肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)糖酵解关键酶三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和热休克蛋白Dna J的相互作用。方法 PCR扩增S.pn D39 GAPDH蛋白编码基因gap全长,将其克隆至p ET-28a(+),重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导GAPDH-6His的表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE鉴定其纯度。重组GAPDH蛋白经腹部皮下免疫昆明小鼠获得多克隆抗体。Western blot鉴定GAPDH的保守性。采用大肠杆菌双杂交系统、直接结合实验、生物膜层干涉技术(Bio-layer Interferometry,BLI)验证GAPDH和Dna J的相互作用。结果获得了纯度达90%的GAPDH重组蛋白,并获得了效价达107的抗GAPDH多克隆抗体,Western blot检测显示在7株不同血清型S.pn的全菌裂解液和培养上清中均存在和抗GAPDH抗体反应的特异性条带。大肠杆菌双杂交系统显示GAPDH和Dna J共转化菌株能够在3-AT平板及双选择培养平板上生长,提示二者在细菌胞内有相互作用。直接结合实验和BLI显示随着加入GAPDH蛋白浓度的增加,二者的结合量也增加,提示GAPDH和Dna J的结合具有浓度依赖性。BLI实验也显示GAPDH和Dna J的亲和常数为1.12×10-7mol/L。结论糖酵解关键酶GAPDH在肺炎链球菌中保守表达,且为分泌性蛋白;该蛋白和热休克蛋白Dna J在细胞内存在相互作用,且为直接相互作用。

3-磷酸甘油醛脱氢酶与酵母线粒体基因组维持蛋白Mgm101的相互作用

采用酵母双杂交方法,以Mgm101p为诱饵,筛选酵母cDNA文库.分离鉴定15个与Mgm101p相互作用的蛋白因子,其中5个阳性克隆均为GPD1编码的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH).克隆了GPD1在S.cerevisi-ae的同系物ScTDH2基因,进行绿色荧光蛋白GFP标记、亚细胞组分分离和蛋白质印迹分析,结果表明,GAP-DH除了在细胞质为糖酵解酶的主要作用外,可能为多功能蛋白,在酵母线粒体中与Mgm101p相互作用参与线粒体DNA维持的生物过程.

链球菌表面三磷酸甘油醛脱氢酶及其突变体重组蛋白的表达和纯化

表达并纯化M6型GAS表面三磷酸甘油醛脱氢酶以及其敲除C末端赖氨酸残基重组蛋白(rGAPDH和rGAPDHΔ345)。克隆了M6型GAS ATCC32175的GAPDH基因以及GAPDHΔ345基因,与pASK-IBA37载体连接后,表达蛋白并用亲和层析色谱纯化重组蛋白;对重组蛋白进行质谱检测,并用酶切方法进一步纯化目的蛋白,通过酶促反应实验测定了重组蛋白的生物活性。2种基因克隆条件稳定,蛋白表达量大,酶切后纯度高,纯化的重组蛋白具有较高的生物活性。功表达并纯化了rGAPDH和rGAPDHΔ345蛋白。