过表达多巴胺脱羧酶、酪氨酸羟化酶和三磷酸鸟苷环化水解酶1重组慢病毒构建及其在帕金森病大鼠模型治疗作用的研究

目的构建同时表达3种多巴胺(DA)合成相关酶的重组慢病毒(rLV),验证其在6-羟基多巴胺(6-OHDA)帕金森病(PD)大鼠模型中治疗作用,为PD临床基因治疗提供实验基础。方法构建过表达多巴胺脱羧酶(DDC)、酪氨酸羟化酶(TH)和三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)rLV及对照rLV。6-OHDA制备的PD模型大鼠,随机分为生理盐水组(n=6)、阴性病毒组(n=6)和阳性病毒组(n=12),分别经立体定向向大鼠纹状体注射生理盐水、对照rLV和DDC+TH+GCH1-rLV。观察构建病毒对PD大鼠旋转行为的影响,免疫荧光法检测病毒转染情况,同时使用高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)检测纹状体内DA及其代谢产物改变情况。结果 PD大鼠纹状体注射后,阳性病毒组行为改变与生理盐水组、阴性病毒组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01);阳性病毒组呈现显著的旋转行为改善。免疫荧光显示阳性病毒转染表达有TH活性的阳性细胞。阳性病毒组纹状体内DA及其代谢产物与生理盐水组、阴性病毒组比较,显著增高(P<0.01)。结论成功构建过表达DDC+TH+GCH1-rLV,并且在PD模型大鼠中呈现显著的行为改善及DA水平增加,为PD的基因治疗提供实验基础。

三磷酸鸟苷环化水解酶1调控的小胶质细胞环状RNA的表达

目的分析三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)在体外调控小鼠小胶质细胞(BV2)中环状RNA的相关表达。方法将BV2培养传代后转染病毒,分为低表达GCH1病毒载体组(Ad-shGCH1,n=3)与对照病毒载体组(Ad-NC,n=3)两组样本。孵育48 h观察转染效率并利用TRIzol试剂提取总RNA。使用第二代环状RNA(circRNA)高通量测序分析Ad-shGCH1与Ad-NC两组样本,筛选差异表达的环状circRNA。circRNA测序数据使用R包edge R计算基于负二项分布模型的fisher精确检验来确定差异显著性。应用编码-非编码基因共表达(CNC)网络分析对表达差异显著的circRNAs进行生物信息学分析,最后通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证。结果与对照组比较,Ad-shGCH1中mmucirc0001322(实验组CPM值:10.40,对照组CPM值:7.63,P<0.05)、mmucirc0000454(实验组CPM值:10.84,对照组CPM值:8.20,P<0.05)、mmucirc0001383(实验组CPM值:10.76,对照组CPM值:8.53,P<0.05)、mmucirc0000898(实验组CPM值:11.22,对照组CPM值:9.32,P<0.05)发生高于对照组,差异有统计学意义,mmucirc0000652低于对照组(实验组CPM值:7.94,对照组CPM值:10.83,P<0.05)(倍数变化>1.2倍),差异有统计学意义。CNC分析表明mmucirc0000652可能通过参与特定的网络或生物学过程参与调控丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)而发挥作用。结论GCH1调控的circRNA可能参与体外小胶质细胞的炎症过程。

三磷酸鸟苷环化水解酶1和四氢生物蝶呤与神经性疼痛的研究进展

神经性疼痛是临床最常见的慢性疼痛之一,针对其治疗一直以来都是全球的难点,主要原因是其发病机制不明.三磷酸鸟苷环化水解酶1（GCH1）通过调节相关炎性因子介导神经性疼痛的发生,除此之外GCH1也是四氢生物蝶呤（BH4）合成过程中最主要的限速酶.BH4是各种炎性因子和神经递质合成必需的辅因子.在研究其与疼痛的关系时,发现当沉默GCH1基因后伴随疼痛缓解,BH4表达降低.结果提示GCH1和BH4与神经性疼痛有一定的关系.

人三磷酸鸟苷酸环化水解酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 研究人三磷酸鸟苷酸环化水解酶Ⅰ (GCHⅠ )基因在多巴胺代谢过程中的作用。 方法 从人胚胎肝脏中提取总RNA ,以RT PCR法扩增GCHⅠcDNA ,克隆于PGEM T easy载体中 ,测序正确后再构建真核表达载体 ,转染猴肾成纤维细胞系COS7,原位杂交检测其表达。 结果 RT PCR扩增出 90 4bp的cDNA ,并成功构建真核表达载体pCI neo GCHⅠ ,原位杂交证实其在COS7表达阳性率为 70 %～ 80 %。 结论 GCHⅠ有望用于帕金森病的基因治疗。

非诺贝特通过上调三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ促进eNOS复偶联

目的探讨非诺贝特发挥降脂外血管内皮保护作用的机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HU-VECs),非诺贝特预处理HUVECs 2 h,再与脂多糖(LPS)共孵育24 h。采用Western blot检测三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ(GTPCH-Ⅰ)的表达水平,高效液相色谱法检测四氢生物蝶呤(BH4)的表达水平,ELISA检测细胞上清一氧化氮(NO)浓度,利用Confocal方法检测细胞活性氧(ROS)产生水平。结果非诺贝特预处理后,较单纯LPS刺激组,细胞内BH4表达水平及细胞上清NO产生增多,伴有细胞内ROS产生减少(P均<0.05);此外,单独给予非诺贝特处理内皮细胞后,可见浓度依赖性上调细胞GTPCH-Ⅰ的表达,非诺贝特(10μmol/L)上调GTPCH-Ⅰ的表达在12 h达到高峰。结论非诺贝特通过上调内皮细胞GTPCH-Ⅰ的表达而增加BH4的水平,进而促进内皮型一氧化氮合酶的复偶联,改善血管内皮功能。

I型三磷酸鸟苷环化水解酶在2型糖尿病大鼠主动脉表达的改变

目的:探讨血管内皮功能异常状态下,I型三磷酸鸟苷环化水解酶(GTPCH I)mRNA在2型糖尿病及硫辛酸干预大鼠主动脉中的表达。方法:选择雄性Wistar大鼠35只,随机选择10只作为正常对照组(NC组),25只采用高脂饲料喂养8周后,小剂量链脲佐菌素注射诱导建立2型糖尿病大鼠模型(成模21只),其中10只给予硫辛酸50 mg/kg腹腔注射,作为硫辛酸干预组(LA组),其余11只作为2型糖尿病组(T2DM组)。所有大鼠饲养16周后均处死测定其主动脉舒张功能,并用半定量RT-PCR检测主动脉GTPCH ImRNA表达。结果:T2DM组和LA组主动脉的内皮依赖性血管舒张(EDVR)明显减弱,而LA组较T2DM组有明显改善(P<0.05)。主动脉GTPCH I mRNA的表达在T2DM组下降70.28%,LA组下降26.88%,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:T2DM大鼠离体主动脉EDVR减弱时,主动脉GTPCH I mRNA表达显著下降。硫辛酸可改善EDVR,此作用可能与改善GTPCH I mRNA表达有关。

亚砷酸钠对Chang肝细胞鸟苷三磷酸环化水解酶及6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶的mRNA表达水平的影响

目的研究亚砷酸钠(NaAsO2)对Chang肝细胞鸟苷三磷酸环化水解酶I型(GTPCH)及6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(PTPS)的mRNA表达水平的影响。方法分别以不同浓度NaAsO2(0、50、200及400μmol/L)染毒人类Chang肝细胞株12h。以MTT法测定细胞活力,以RT-PCR法测定GTPCH和PTPS mRNA的表达水平。结果50μmol/L剂量组细胞活力与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),其他两组细胞活力均显著低于对照组(P<0.05);50、200及400μmol/L剂量组GTPCH和PTPS的mRNA表达水平与对照组相比均显著下降(P<0.05),且呈剂量-效应关系。结论NaAsO2暴露引起Chang肝细胞四氢生物蝶呤(BH4)合成酶GTPCH和PTPS的mRNA表达水平下降可能与砷致色素代谢异常有关。

汉族多巴敏感性肌张力障碍三个家系的分子遗传学研究(英文)

背景:多巴敏感性肌张力障碍(dopa-responsivedystonia,DRD)的基本病因为遗传的缺陷,自1990年以来,中国有关本病的临床报道已有40余例,但相关的分子遗传研究报道较少。目的:分析国人DRD患者发病与三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH-1)基因突变的关系。设计:典型调查。地点和对象:来自3个家庭的5例于2000-10/2001-07在解放军第二军医大学长海医院神经内科确诊的DRD患者及其亲属共12个成员。方法:经静脉采血2mL,常规提取基因组DNA,以PCR扩增GCH-1基因,反应产物用自动DNA测序仪直接测序。主要观察指标:三个家系中是否有基因突变。结果:在A家系,先证者母亲为正常个体,基因测序显示无基因突变,其中3例患病个体DNA测序发现第2个外显子142号碱基由鸟嘌呤转换为腺嘌呤(G→A),导致半胱氨酸被替换为酪氨酸;估计其突变基因来自已故父系一方。在B家庭,先证者第一个外显子71号碱基由胸腺嘧啶转换为胞嘧啶(T→C),导致亮氨酸被替换为脯氨酸;而其父母及弟均为正常个体。C家庭无GCH-1基因突变。结论:GCH-1基因突变只是部分DRD患者的发病原因。

IQ结构域三磷酸鸟苷酶激活蛋白1的表达对甲状腺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的观察IQ结构域三磷酸鸟苷（GTP）酶激活蛋白1（IQGAP1）在甲状腺癌细胞增殖和侵袭中的作用。方法通过Westernblot对IQGAP1在甲状腺癌细胞中的表达进行分析，然后敲低IQGAP1表达后检测17β-雌二醇（E2）条件下雌激素受体仅（ERa）的转录活性，以及细胞增殖和细胞迁徙。结果甲状腺癌细胞内IQGAP1表达明显上调，为正常细胞的5．0倍（P〈0．05）。敲低IQGAP1表达后甲状腺癌细胞增殖能力明显降低，24h增殖率为79．27％，48h为57．49％，72h为55．14％（P〈0．05），细胞迁徙率明显减低（细胞浸润数从115个降至45个），E2条件下ERa的转录活性显著下调（1．45降至0．28，P〈0．05）。敲低ERa可阻断IQGAP1过表达引起的磷酸化细胞外信号调节激酶1／2（p-ERK1／2）和细胞周期蛋白D1（CyclinD1）蛋白表达上调（相对值分别从1．95降至0．40，1．75降至0．35，P〈0．05）。结论IQGAP1可与ERa相互作用，调节甲状腺癌进展过程中ERa的转录活性，影响甲状腺癌细胞的增殖和侵袭。

抗病毒限制因子SAMHD1的研究进展

“限制因子”这一概念最早出现于上世纪七十年代[1],虽然到目前为止也尚未对其给出明确的定义,但可以确定它们是一类细胞内可限制病毒复制并保护宿主抵御病毒感染的蛋白。近些年,在对HIV-1的研究中发现,在病毒感染的细胞内存在一些具有抑制病毒复制的蛋白,而这些蛋白被认为是可以保护宿主免受病毒感染的宿主抗病毒限制因子。

微小RNA-124调控靶基因IQ结构域三磷酸鸟苷合酶-激活蛋白1的表达抑制甲状腺乳头状癌细胞生长、侵袭、转移的研究

目的检测微小RNA（miRNA，miR）-124在甲状腺乳头状癌（PTC）组织中的表达，探讨miR-124在PTC发生发展、侵袭转移中的相关功能机制，验证IQ结构域三磷酸鸟苷合酶-激活蛋白1（IQGAP1）为miR-124的靶基因。方法收集手术切除并经病理检查确诊的不同病理学背景的甲状腺组织。检测miR-124在上述组织中的表达。选取3个PTC细胞株及正常甲状腺细胞株检测miR-124的表达差异。将人类miR-124模拟物（Has—miR-124 mimics）转染入K1细胞，检测转染后miR-124的表达。同时检测下游靶基因IQGPAl的表达；噻唑蓝（MTr）法、划痕实验、Transwell法、流式细胞学检测细胞生物学活性变化。运用生物信息学预测IQGAPl为miR-124的可能的下游靶基因并用双荧光素酶报告基因系统验证。结果有转移PTC淋巴结转移灶中miR-124的相对表达量为1．120±0．104，低于转移PTC原发灶、无转移PTC、正常甲状腺组织中miR-124的表达量（P〈0．05）。PTC细胞株中miR-124的表达也较正常甲状腺细胞株明显降低（P〈0．05）。miR-124 mimics转染K1后检测证实miR-124被成功增强。K1细胞中miR-124表达增强后24～72h后活细胞数目明显少于对照组（P〈0．05）。迁徙能力为对照组的50％，侵袭能力为对照组的40％（P〈0．05）。细胞增殖指数降低，凋亡增加（P〈0．05）。用生物信息学方法预测IQGAPl为miR-124的可能靶基因。证实miR．124增强后IQGAP]的表达量有不同程度地降低。证实了IQGAPl为miR-124的下游靶基因。结论miR-124在PTC及PTC细胞株中低表达。miR-124表达增强后，K1细胞的迁徙侵袭、增殖能力降低，凋亡增加。生物信息学预测，IQGAP1为miR-124的靶基因。miR-124表达增强后，K1细胞中的IQGAP1表达降低。

沉默含IQ结构域的三磷酸鸟苷激酶活化蛋白1可提高食管鳞状细胞癌细胞对顺铂的敏感性

研究发现具有IQ结构域的GTP激酶活化蛋白1（IQGAP1）过表达与食管鳞状细胞癌的侵袭转移密切相关。

GLP-1类似物的葡萄糖浓度依赖性降糖机制研究

目的探讨胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物(Exendin-4)对MIN6细胞的葡萄糖浓度依赖性降糖作用机制。方法检测GLP-1类似物(Exendin-4)在不同葡萄糖浓度下对体外培养的MIN6细胞的ATP水平、cAMP含量、腺苷酸环化酶活性和胰岛素分泌量的变化。结果在2.8 mmol/L葡萄糖培养条件下,Ex-endin-4使细胞三磷酸腺苷(ATP)水平无明显变化,环磷酸腺苷(cAMP)含量、腺苷酸环化酶活性和胰岛素分泌量无明显增加(P>0.05);在25 mmol/L葡萄糖培养条件下,Exendin-4使细胞ATP水平明显降低,cAMP含量、腺苷酸环化酶活性和胰岛素分泌量明显增加(P<0.05)。结论 GLP-1类似物(Exendin-4)具有葡萄糖浓度依赖的促胰岛素分泌作用,细胞内cAMP含量增加是其引起胰岛素释放的关键环节。

宫颈癌组织中RACK1、IQGAP1表达及与患者临床病理特征和β-连环蛋白相关性

目的:分析宫颈癌组织中激活的白激酶C受体1(RACK1)、IQ序列三磷酸鸟苷酶激活蛋白(IQGAPl)表达及与临床病理特征和β-连环蛋白(β-catenin)的相关性。方法:收集2018年1月-2020年12月本院行宫颈癌手术治疗的患者106例临床资料,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫组化技术检测RACK1、IQGAP1、β-catenin mRNA和蛋白表达,分析宫颈癌组织中RACK1、IQGAP1表达及与临床病理特征和β-catenin的相关性。结果:宫颈癌组织中RACK1 mRNA的相对表达量(0.27±0.11)低于癌旁组织(0.75±0.19),IQGAP1 mRNA(0.65±0.18)、β-catenin mRNA(0.61±0.21)高于癌旁组织(0.22±0.13、0.32±0.17),RACK1蛋白阳性率(18.9%)低于癌旁组织(63.2%),IQGAP1(76.4%)、β-catenin(68.9%)蛋白阳性率高于癌旁组织(28.3%、31.1%)(均P<0.05)。RACK1在高分化、TNM分期为I期、无淋巴结转移的宫颈癌组织中阳性率高于中低分化、TNM分期为II-III期、有淋巴结转移患者的组织,IQGAP1在中低分化、TNM分期为II-III期的宫颈癌组织中阳性率高于高分化、TNM分期为I期组织(均P<0.05)。宫颈癌中RACK1表达与β-catenin呈负相关(r=-0.405,P<0.05),IQGAP1表达与β-catenin呈显著正相关(r=0.346,P<0.05)。结论:宫颈癌组织RACK1低表达,IQGAP1高表达;RACK1蛋白表达异常可能与患者宫颈癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移及β-catenin表达有关,IQGAP1蛋白表达异常可能与分化程度、TNM分期及β-catenin表达有关。

GCH1基因突变致多巴反应性肌张力不全一例

多巴反应性肌张力不全(DRD)是一种常染色体显性或隐性遗传运动障碍疾病,病理特征为黑质纹状体多巴胺含量减少,主要表现为儿童期肌张力障碍,小剂量左旋多巴可以改善症状。三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)基因是其致病基因之一。该文报道1例GCH1基因突变所致的DRD患儿,其以步态异常为主诉,行走时出现肌张力不全姿势,症状晨轻暮重,经基因检测证实其GCH1基因出现杂合性突变。接受小剂量左旋多巴治疗后患儿神经系统体征基本消失,于小儿神经科门诊随诊2年,运动功能良好。临床上对于病因不明的肌张力障碍患儿,需警惕DRD的可能,尽早识别和治疗可明显改善预后,预防残疾的发生。

电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠皮质Slit-Robo三磷酸鸟苷酶激活蛋白-1和细胞分裂周期蛋白42表达的影响

目的:观察电针对大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠皮质Slit-Robo三磷酸鸟苷酶激活蛋白-1(Slit-Robo GTPase-activating protein-1,srGAP 1)和细胞分裂周期蛋白42(cell division-cycle 42,Cdc 42)表达的影响,探讨srGAP 1和Cdc 42在电针治疗MCAO后神经恢复中的作用。方法:雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、非经穴组和电针组,每组12只。利用改进的Longa法复制MCAO模型。电针组取"曲池""足三里"穴,非经穴组取手足阳明经与少阳经之间非经穴处,每日1次,每次30min,共14d。分别在术后1、3、7、14d时间点对各组大鼠进行神经功能评分(mNSS),并利用免疫荧光法检测缺血侧大脑皮质中srGAP 1和Cdc 42的荧光强度及分布,用免疫印迹(Western blot)法检测大鼠梗死区周围大脑皮质中srGAP1和Cdc 42蛋白表达。结果:神经功能评分显示,在术后7、14d时电针组较模型组、非经穴组同时间段的mNSS评分显著降低(P<0.01)。免疫荧光检测结果显示,srGAP 1和Cdc 42主要在细胞质表达;模型组srGAP 1高于正常组(P<0.01),而电针组显著低于模型组和非经穴组(P<0.01);模型组Cdc 42显著低于正常组(P<0.01),而电针组明显高于模型组和非经穴组(P<0.01)。Western blot检测结果显示,模型组srGAP 1蛋白表达量较正常组明显升高(P<0.01),电针组srGAP 1蛋白表达显著低于模型组及非经穴组(P<0.01);模型组Cdc 42蛋白表达量与正常组的差异无统计学意义(P>0.05),而电针组Cdc 42蛋白表达显著高于模型组和非经穴组(P<0.01)。结论:局灶性脑缺血再灌注后大鼠脑损区周围皮质srGAP 1明显增高,而Cdc 42明显减少,这可能与srGAP 1使Cdc 42失活有关;电针治疗后srGAP 1显著下调,而Cdc42上调,可能是电针促进脑梗死后神经功能恢复的机制之一。

人、猪和鸡源SAMHD1蛋白的酶活性研究

SAMHD1蛋白是一种天然免疫限制因子,利用其d NTP水解酶活性或核酸酶活性抑制病毒的复制,具有广谱抗病毒功能.利用生物信息学分析该蛋白家族序列保守性,并借助HPLC层析色谱分析与酶活性测定和酶标仪方法,对人源、猪源和鸡源三物种SAMHD1蛋白的酶活性进行了比较.比对发现SAMHD1蛋白在活性空腔、变构位点及磷酸化位点等处序列上具有高度的保守性;而且发现猪源和鸡源SAMHD1蛋白同样具有d NTP水解酶和核酸酶活性;3种蛋白中,人源SAMHD1蛋白d NTP水解酶活性最高,猪源蛋白核酸酶活性最低.这一结果为研究SAMHD1蛋白家族的结构功能关系及为畜牧业优良品种的开发提供启示.

酪氨酸羟化酶基因新突变导致多巴反应性肌张力障碍家系分析

【目的】研究多巴反应性肌张力障碍(DRD)家系TH基因突变特点。【方法】提取先证者及其父母和两个姐姐外周血基因组DNA,使用高通量测序(NGS)的方法对已知肌张力及运动障碍相关的256个致病基因进行检测。【结果】家系中2例患者(先证者和其大姐)的酪氨酸羟化酶(TH)基因外显子14、9存在c.1481C>T(p.Thr494Met)、c.943G>A(p.Gly315Ser)复合杂合突变,父母分别携带一个杂合突变,其表型正常的二姐和50名正常对照者均未检测到该突变。【结论】TH基因c.1481C>T(p.Thr494Met)、c.943G>A(p.Gly315Ser)突变导致了该DRD家系的基因异常,并且发现了新的TH基因突变,扩展了DRD基因型与临床表型的关系谱,对DRD的早期精准诊断和治疗是改善预后的关键。

国人多巴敏感性肌张力障碍的分子遗传学研究

目的:分析国人多巴敏感性肌张力障碍(DRD)患者发病与三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ(GCH-I)基因突变的关系。方法:来自3个家庭的5例临床确诊的DRD患者及其亲属共12名成员,经静脉采血2 ml,常规提取基因组DNA,以PCR扩增GCH-I基因,反应产物用自动DNA测序仪直接测序。结果:在A家系,先证者母亲为正常个体,基因测序显示无基因突变,其中3例患病个体DNA测序发现第2个外显子142号碱基由鸟嘌呤转换为腺嘌呤(G→A),导致半胱氨酸被替换为酪氨酸;估计其突变基因来自已故父系一方。在B家系,先证者第1个外显子71号碱基由胸腺嘧啶转换为胞嘧啶(T→C),导致亮氨酸被替换为脯氨酸;而其父母及弟均为正常个体。丙家庭无GCH-I基因突变。结论:GCH-1基因突变只是部分DRD患者的发病原因。

四氢生物蝶呤合成通路在神经病理性疼痛方面的研究进展

慢性疼痛是临床中最常见的症状之一,严重威胁着人类的健康,日益受到医务人员的重视。神经病理性疼痛(NP)是最常见的慢性疼痛之一,目前仍缺乏有效的治疗措施,主要原因是其发病机制不明。大量研究表明,四氢生物蝶呤(BH4)合成通路在NP中扮演着重要角色,极有望成为NP治疗的新靶点。本文就BH4合成通路在NP方面的研究进展作一综述。