胆管癌细胞体外三维培养模型建立与二维培养体系中生长代谢的比较

背景:二维细胞培养是目前体外研究恶性肿瘤和检测抗肿瘤药物的常用方法,但存在局限性。目的:建立胆管癌细胞体外三维培养模型,比较在二维和三维培养体系中胆管癌细胞生长及代谢的差异。方法:将胆管癌细胞株QBC939培养于二维培养体系及Cytodex-3或Cytopore-2的三维培养体系中,观察细胞形态和数量,测定培养上清液中葡萄糖、乳酸浓度,计算细胞生长代谢动力学参数。结果与结论:与二维和Cytodex-3三维培养体系相比,由Cytopore-2构成的三维培养体系中细胞在微载体上贴壁率较高,分布均匀,所达到的细胞密度最高,且细胞的葡萄糖比消耗速率和乳酸比生成速率明显低于二维和Cytodex-3三维培养系统(P<0.05)。结果证实,采用Cytodex-3或Cytopore-2微载体培养体系均可建立胆管癌细胞的三维培养模型,且Cytopore-2三维培养体系优于二维和Cytodex-3三维培养体系。

Ⅰ型鼠尾胶原三维培养模型对树突状细胞形态及分泌能力的影响

目的:通过构建Ⅰ型鼠尾胶原三维(3D)培养模型,探索细胞外力学微环境对DCs产生的影响。方法:取健康人外周血来源的CD14+单核细胞,利用重组人白介素-4(rh IL-4)和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)共同诱导5 d,获得未成熟DCs(im DCs),再利用重组人干扰素-γ(rh IFN-γ)和脂多糖(LPS)诱导im DCs为成熟DCs(mDCs);再利用鼠尾肌腱提取Ⅰ型鼠尾胶原体外培养DCs;FITC-Annexin-V和碘化丙啶(PI)标记细胞,检测DCs的凋亡率;酶联免疫吸附测定法检测DC的白细胞介素-12(IL-12)、IL-18和IL-1β的分泌水平。结果:与对照组相比,3D力学环境处理后细胞形态发生改变,细胞早期凋亡率降低,IL-18和IL-1β的分泌能力发生下调(P<0.05)。结论:细胞外3D力学微环境能够调控DCs的免疫功能。

尖锐湿疣动物模型及三维细胞培养模型研究进展

尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒感染引起的人肛门生殖器增生性病变为主要表现的性传播疾病,对患者生活质量及身心健康造成了极大的影响。在各项尖锐湿疣的研究中,构建尖锐湿疣的体内、体外模型至关重要,但目前模型分类尚不清晰,这限制了相关研究的开展。通过总结HPV相关疾病动物模型和三维细胞培养模型研究进展,为构建尖锐湿疣模型整理了相关理论依据,供感兴趣的研究者参考。

血清在构建角膜基质细胞体外三维培养模型中的作用

目的研究血清在构建角膜基质细胞体外三维培养模型中对细胞生长情况及胶原纤维生成的影响,为体外研究角膜基质细胞外基质(ECM)纤维化提供新的培养模型。设计实验研究。研究对象牛角膜基质细胞。方法分离原代牛角膜基质细胞,取第一代细胞作为种子细胞构建Pellet模型,实验分为对照组(DMEM/F12)和血清组(DMEM/F12+10%胎牛血清FBS)。Pellet模型培养3周后,肉眼观察细胞生长状态,同时进行HE染色及Calcein AM/PI染色测定细胞活性,并应用MASSON染色及透射电子显微镜(TEM)观察胶原纤维的形成、走向及排列情况。主要指标细胞生长状态、细胞活性、胶原纤维走向及排列情况。结果Pellet模型培养3周后,对照组未观察到角膜基质细胞抱团生长现象,且细胞易松散,难以进行后续实验;血清组Pellet模型中细胞明显成簇生长,呈粒状,结合牢固。Calcein AM/PI染色及HE染色可见血清组大多数细胞存活且密集生长,细胞结构完整。MASSON染色示血清组较多胶原纤维显色,并于TEM下观察到胶原纤维密集分布于细胞外且走向紊乱。结论含血清的培养环境能成功构建牛角膜基质细胞体外Pellet三维培养模型,且能生成含有胶原纤维的ECM。

人神经内分泌瘤细胞BON-1和H727细胞株三维培养模型的构建

目的建立人神经内分泌瘤细胞的体外三维培养模型。方法制备琼脂糖凝胶、海藻酸盐/聚丙烯酰胺共聚物（ALG/PAAm）水凝胶及聚乙二醇（PEG）交联聚甲基乙烯基醚-alt-马来酸（PMVE-alt-MA）水凝胶，基于这3种材料构建人神经内分泌瘤H727及BON-1细胞株三维培养模型，每24 h通过倒置相差显微镜观察其形态学变化。结果三维培养下H727及BON-1细胞的形态不同于二维平面培养；培养至1周左右，H727细胞在琼脂糖凝胶、ALG/PAAm水凝胶及PEG交联PMVE-alt-MA水凝胶中分别形成了球径350～450、150～250及50～100 μm的多细胞球体；而BON-1细胞在PEG交联PMVE-alt-MA水凝胶中则生长成球径150～200 μm的多细胞球体，但在另外两种材料中仅形成形状不规则的多细胞聚集体。结论该3种材料可应用于H727及BON-1细胞株体外三维培养模型构建，且各有优劣之处，可根据具体的实验要求选择合适的培养材料。

三维共培养模型下人脐静脉内皮细胞对T24膀胱癌细胞侵袭、迁移及增殖能力的影响

目的:研究人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对T24膀胱癌细胞侵袭、迁移及增殖能力的影响。方法:构建HUVEC和T24膀胱癌细胞的Trans-well共培养模型(共培养组),与T24膀胱癌细胞非共培养组进行比较,分别应用Trans-well小室、Matrigel胶及CCK-8法比较两组细胞的侵袭、迁移及增殖能力。结果:侵袭实验24h后,共培养组与非共培养组的侵袭细胞数目分别为(93.22±27.35)个、(52.04±22.54)个,共培养组侵袭细胞数显著高于非共培养组(P<0.01)。迁移实验24h后,共培养组与非共培养组的迁移细胞数目分别为(183.62±62.07)个、(66.80±23.36)个,共培养组迁移细胞数显著高于非共培养组(P<0.01)。在增殖实验中,共培养组和非共培养组的吸光度(OD)值在第3、第4、第5天分别为(1.128±0.125)、(0.866±0.068)、(1.536±0.098)和(1.103±0.153)、(1.910±0.139)、(1.550±0.177)。共培养组的细胞增殖率显著高于非共培养组(P<0.01)。结论:在三维共培养条件下,HUVEC对T24膀胱癌细胞的侵袭、迁移及增殖能力均有促进作用。

三维共培养模型下人脐静脉内皮细胞对鼻咽癌CNE2细胞侵袭、迁移及增殖能力的影响

目的探讨三维共培养下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对CNE2细胞侵袭、迁移及增殖能力的影响。方法采用Transwell小室对HUVEC细胞和CNE2细胞进行共培养,CCK-8法比较两组实验中CNE2细胞增殖能力,细胞计数法比较细胞迁移能力,以及Matrigel胶法比较侵袭能力。结果 HUVEC与CNE2共培养条件下,共培养组迁移能力显著高于非共培养组(P<0.01)。共培养组侵袭能力显著高于非共培养组(P<0.01)。在增殖实验中,共培养组和非共培养组的OD值第3天,第4天及第5天,共培养组的细胞增殖率显著高于非共培养组(P<0.05)。结论在三维共培养条件下,HUVEC对CNE2鼻咽癌细胞的侵袭、迁移及增殖能力有促进作用。

Matrigel三维培养模型对乳腺癌细胞整合素β1的定位及胞外基质粘附的影响

目的:观察Matrigel三维(3D)培养模型对乳腺癌细胞形貌、细胞整合素β1的定位及其介导的细胞与胞外基质(extracellular matrix,ECM)层粘连蛋白,纤连蛋白和IV型胶原蛋白粘附能力的影响。初步探索在二维(2D)和3D不同培养模式下乳腺癌细胞与ECM的相互作用,揭示肿瘤微环境对肿瘤细胞的影响:方法:分别在2D及3D培养模型下进行乳腺癌细胞MDA-MB-435S及MDA-MB-231的体外培养,钙黄绿素CalceinAM检测细胞存活力,免疫荧光分析整合素灿的定位,粘附率实验检测细胞对ECM各成分的粘附变化。结果:整合素01在2D及3D培养模型中的定位具有显著差异,其介导的细胞与层粘连蛋白的黏附能力在3D模型中显著下降,而细胞与纤连蛋白和IV型胶原蛋白的粘附能力明显上升。结论:与2D培养结果不同,3D培养模型更能模拟体内3D微环境.可做为新的研究模式揭示肿瘤细胞与ECM的相互作用,以及肿瘤微环境在肿瘤进展中的作用。

人牙囊细胞与胶原凝胶复合煅烧骨三维培养的实验研究

目的:建立人牙囊细胞(dentalfolliclecells,DFCs)的体外三维立体培养模型。方法:取第4代DFCs分别 接种于煅烧骨(sinteredbovinebone,SBB)(A组)、胶原凝胶(B组)、胶原复合煅烧骨三维支架上(C组),并以二维 培养的DFCs(D组)作对照,1周、2周取材,扫描电镜观察细胞形态以及与材料的贴附情况,细胞计数观察细胞在 材料上的增殖情况,组织化学方法检测DFCs的碱性磷酸酶(ALP)活性。结果:扫描电镜见A组、B组和C组细胞 均完全伸展,但C组细胞数量明显增多,细胞外基质分泌增加,优于A组、B组和对照组D组,而对照组细胞在二维 培养条件下复层生长呈膜状结构,膜表面部分细胞脱落死亡,细胞外基质分泌较实验组少。A组与C组的ALP活 性无差异(P>0.05),但显著高于对照组B组和对照组(P<0.05)。1周时3组细胞Ⅰ型胶原合成情况无明显差 异,但2周时C组细胞的Ⅰ型胶原平均灰度值明显高于其他2组(P<0.01)。结论:A、B、C组对DFCs的贴附、增 殖,分化均有影响,但C组作支架最优。胶原凝胶与煅烧骨的复合支架更有利于牙囊细胞的增殖贴附和分化。

人皮肤鳞状细胞癌体外三维模型的建立及高侵袭性鳞癌细胞的生物学评价

目的建立人皮肤鳞癌细胞体外三维培养模型,分离高侵袭性细胞亚群,并比较其生物学特性。方法利用复方壳多糖组织工程皮肤,成功建立人皮肤鳞癌细胞体外三维培养模型,消化分离得到高侵袭性鳞癌细胞亚群,比较肉桂醛和干扰素作用后对不同侵袭特性细胞亚群的增殖抑制效果,同时比较不同侵袭特性细胞亚群在裸鼠中成瘤效果的不同。结果不同浓度的肉桂醛和干扰素对皮肤鳞癌细胞的增殖抑制差异有统计学意义(P<0.01),不同侵袭特性的皮肤鳞癌细胞亚群之间的增殖抑制差异也有统计学意义(P<0.01),另外,两种不同侵袭特性的细胞亚群的成瘤特性差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功建立人皮肤鳞癌体外三维培养模型,同时运用此种三维培养模型能够筛选得到侵袭特性更强的细胞亚群。

不同浓度亚油酸对二维和三维培养模式下奶牛乳腺上皮细胞形态及乳蛋白合成相关基因表达的影响

本试验旨在研究不同浓度亚油酸(LA)对二维(2D)和三维(3D)培养模式下奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)形态及乳蛋白合成相关基因表达的影响。试验采用单因子完全随机试验设计,将P3代的BMECs接种在铺有基质胶(Matrigel)的6孔板中,培养至第3天时,然后在培养基中添加不同浓度(0、40和80μmol/L)的LA作用48 h。在2D和3D培养模型的BMECs中添加相同浓度的LA,比较2D和3D培养模型中BMECs的细胞形态,并采用实时荧光定量法测定乳蛋白合成相关基因的表达。结果表明:1)BMECs在2D培养模型中呈现鹅卵石的形态,而在3D培养模型中呈现腺泡样结构。2)BMECs中乳蛋白合成相关基因在3D培养模型中的表达量显著高于其在2D培养模型中的表达量(P<0.05)。3)α-酪蛋白(CSN1S1)、信号转导转录激活因子5(STAT5A)、真核翻译启始因子4E结合蛋白1(EIF4EBP1)和核糖体p70s6激酶(RPS6K1)的基因表达量在2D和3D培养模型中的变化趋势一致,而κ-酪蛋白(CSN3)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)的基因表达量在2D和3D培养模型中却呈现相反的趋势。综上,对于CSN3、mTOR和AKT1的基因表达量的研究,3D培养模型为更适宜的模型。

血管内皮生长因子对体外三维立体模型中心肌梗死区血管新生的影响

目的建立体外血管发生的三维立体模型,观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对心肌梗死区血管新生的影响。方法将36只SD大鼠随机为3组,其中实验组、模型组两组结扎冠状动脉左前降支,构建急性心肌梗死动物模型;空白对照组只穿线,不结扎前降支血管。建模成功后,实验组于局部梗死心肌内注射0.5 ng/mL VEGF 50μL,模型组注射等量0.9%氯化钠溶液。取前降支近端梗死心肌组织移植在三维立体培养模型中,每天观察新生血管,培养2周内,记录心肌梗死区新生血管形态及密度,2周后免疫组织化学染色验证梗死心肌周围新生血管。结果 (1)空白对照组,模型组及实验组缺血心肌区域均可见新生血管生成,免疫组织化学显示新生血管碱性成纤维细胞生长因子及平滑肌肌动蛋白染色阳性;(2)实验组新生微血管密度多于模型组及空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 VEGF在体外血管三维立体模型中能增加心脏组织块血管新生,从而促进冠状动脉侧支建立,提高冠状动脉灌注,有希望成为心肌梗死治疗的新手段。

TGF-β1对口腔癌相关成纤维细胞在二维和三维共培养条件下迁移的影响

目的通过二维和三维条件下的细胞共培养模型观察转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对口腔癌相关成纤维细胞(carcinoma associated fibroblasts,CAFs)迁移的影响。方法二维培养条件下,以培养基中加入10 ng/mL TGF-β1刺激的CAFs为实验组,以未经处理的CAFs细胞为对照组,通过划痕实验、Transwell实验观察CAFs的迁移现象;通过逆转录病毒转染,培养绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性的CAFs细胞,建立人舌鳞癌细胞SCC25、GFP(+) CAFs和CAFs三维细胞共培养模型,以培养基中加入10 ng/mL TGF-β1刺激下培养的三维模型为实验组,以未加的TGF-β1的三维模型为对照组,观察在三维模型的细胞迁移现象。结果在二维培养条件下验证了10 ng/mL TGF-β1可促进口腔CAFs的迁移;成功建立SCC25、GFP(+) CAFs和CAFs三维细胞共培养模型,观察到CAFs和口腔癌细胞的迁移现象,但10 ng/mL的TGF-β1对上述细胞的迁移在三维条件下无明显促进作用。结论体外TGF-β1对口腔CAFs迁移的影响与二维和三维不同培养模式有关。

丙泊酚作用NLRP3/ASC/caspase-1通路对肺癌A549细胞焦亡的影响

目的探讨丙泊酚作用核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/凋亡相关斑点样蛋白(ASC)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)通路对A549细胞焦亡的影响。方法超低吸附培养法建立肺癌A549细胞三维培养模型,建立模型后采用不同浓度丙泊酚作用肺癌A549细胞,CCK-8法检测丙泊酚对A549细胞增殖的影响;酶联免疫吸附法检测肺癌A549细胞上清炎性细胞因子白细胞介素(IL)-18、IL-1β、IL-6表达水平变化;蛋白免疫印迹法检测各组焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、caspase-1、焦孔素蛋白N端(GSDMD-N)、IL-1β表达水平。结果三维培养下,A549细胞间有聚拢黏附趋势,培养12 h即可清晰观察到细胞球。与空白对照组相比,随着丙泊酚浓度增加,肺癌A549细胞存活率依次降低(P<0.05);肺癌A549细胞上清炎性细胞因子IL-18、IL-1β、IL-6、焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β表达水平依次增加(P<0.05)。结论超低吸附培养法成功建立肺癌A549细胞三维培养模型,丙泊酚通过激活NLRP3/ASC/caspase-1通路促进细胞焦亡,进而抑制肺癌A549细胞增殖。

应用多种水凝胶支架材料构建三维神经干细胞培养模型

该研究以鼠尾胶原、透明质酸以及海藻酸钠为主要成分,同时添加功能化的层粘连蛋白形成12种生物材料支架。应用大鼠神经干细胞(rat neural stem cells,r NSCs)体外培养,比较了支架的生物相容性和功能特点。结果显示,鼠尾胶原和透明质酸支架形成的三维多孔结构利于r NSCs的黏附,培养7 d后,1 mg/m L胶原组内的细胞活力更强,而含15%交联剂的层粘连蛋白–透明质酸支架内细胞与神经突触相互缠绕,展现出更明显的神经元样生理形态和特异性蛋白。1.5%海藻酸钠胶珠内的细胞呈球体生长,更适用于进行细胞的大规模动态培养。该研究构建的支架与r NSCs具有良好的生物相容性,利于其增殖和分化。因此,r NSCs分化后的神经元与水凝胶构成的三维培养模型,有望进一步应用于神经退行性疾病的研究和相关药物检测中。

三维胶原培养模型中MRC-5细胞的生长状态及病毒感染

该研究以鼠尾I型胶原为支架构建了人胚肺成纤维细胞MRC-5三维立体培养模型,探索在此模型中常规培养液和PDGF(platelet-derived growth factor)培养液对MRC-5细胞生长状态的影响,以及这两种培养液对细胞在胶原表面上生长状态的影响。应用此模型初步观察了人巨噬细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)的感染。结果显示,常规培养液和PDGF培养液均能使细胞相互交错,形成多层的三维立体网状结构。PDGF培养液有利于早期促进细胞呈树突状伸展,常规培养液更有利于细胞在较长时间内维持多层立体的网状结构。常规培养液可促进细胞在胶原表面聚集,PDGF培养液则有利于细胞以单个细胞方式进行迁移。三维胶原体系内生长的MRC-5细胞感染HCMV病毒后,也能呈现明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)。由此提示,鼠尾I型胶原与MRC-5细胞构成的三维培养模型,有望进一步应用于细胞生物学、形态学以及病毒感染的研究。

采用三维模型探索香烟烟雾提取物(CSE)对A549细胞的影响

本研究采用D-型和L-型自组装短肽作为纳米纤维支架材料进行细胞三维培养体系平台,探索香烟烟雾提取物(CSE)诱导人类Ⅱ型肺泡上皮(A549)细胞氧化损伤后,考察其细胞行为在二维和三维微环境下的差异。A549细胞分别在二维和三维环境中用不同浓度的CSE溶液诱导24 h、48 h或72 h之后,进行细胞增殖活力,乳酸脱氢酶(LDH),细胞周期,细胞凋亡检测,以及运用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染色观察A549细胞形态。结果表明,与二维环境相比,在三维环境中细胞活力更高,LDH释放量较少,细胞凋亡减少。细胞的周期分布检测表明,随着CSE浓度的增大,发生G1期阻滞;当15%,50%CSE作用时,与二维环境相比,三维培养环境中的G1期细胞比例更低,G2期和S期更高,G1期阻滞减弱。上述结果均表明D-型和L-型肽手性自组装短肽能够构建出适于A549细胞生长、增殖的三维微环境,并能模拟细胞胞外基质,对细胞形态、增殖、周期及凋亡等有重要影响。