含人脂肪来源蛋白复合物的三维生物打印墨水的创面修复效应初探

目的探讨人脂肪来源蛋白复合物(ADPC)对人皮肤成纤维细胞(HSF)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移能力的影响,以及含ADPC的三维生物打印墨水(Bioink)在裸鼠全层皮肤缺损创面中的修复效应。方法采用实验研究方法。收集解放军总医院2020年10月—2021年3月收治的3例行腹部皮瓣转移修补术的女性慢性创面患者(年龄29~34岁)的废弃皮下脂肪组织和同期收治的3名行腹部抽脂术的健康女性(年龄24~36岁)的废弃抽脂术脂肪组织,分别制备正常ADPC(nADPC)及抽脂术ADPC(lADPC)。采用二辛丁酸法测定2种ADPC的蛋白浓度,计算2种ADPC的提取效率,样本数均为3。取对数生长期HSF和HUVEC进行后续实验。取2种细胞均按随机数字表法(分组方法下同)分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、4μg/mL nADPC组、20μg/mL nADPC组、100μg/mL nADPC组和200μg/mL nADPC组,每组5孔。PBS对照组细胞采用PBS培养,余4组分别采用含相应终质量浓度的nADPC培养。常规培养24 h,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活力。取HSF和HUVEC,分为PBS对照组、单纯nADPC组、单纯lADPC组、单纯肿瘤坏死因子α(TNF-α)组、TNF-α+nADPC组、TNF-α+lADPC组。PBS对照组与单纯TNF-α组细胞分别加入PBS,单纯nADPC组、单纯lADPC组、TNF-α+nADPC组及TNF-α+lADPC组中分别加入终质量浓度100μg/mL的nADPC或lADPC,单纯TNF-α组、TNF-α+nADPC组及TNF-α+lADPC组再加入终质量浓度20 ng/mL的TNF-α。进行细胞划痕试验后计算划痕后24 h细胞迁移率(样本数为3),同前检测培养24 h细胞增殖活力(样本数为5)。取明胶-海藻酸钠复合Bioink(Bioink AG),制备含100μg/mL lADPC的Bioink AG(lADPC-Bioink AG),观察二者在室温下及冷凝后的形态和三维生物打印且交联后的形态,采用流变仪检测流变性能时记录低温成胶时间(样本数为3)。取20只8~10周龄雌性BALB/c-NU裸鼠,建立背部全层皮肤缺损创面模型后,分为常规换药组、单纯lADPC组、单纯Bioink AG组和lADPC-Bioink AG组,每组5只。常规换药组裸鼠创面仅覆盖水胶体敷料和常规换药,其余3组裸鼠创面另予相应lADPC、Bioink AG、lADPC-Bioink AG处理。从治疗0 d起,行大体观察,计算治疗2、6、10 d的创面愈合率。治疗10 d,采用苏木精-伊红染色行创面组织病理学观察。对数据行独立样本t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、SNK-q检验及LSD-t检验。结果lADPC的蛋白浓度、提取效率分别为(1.306±0.011)mg/mL、(11.1±1.5)%,明显低于nADPC的(2.039±0.042)mg/mL、(22.2±2.0)%(t=23.83、6.38,P<0.05或P<0.01)。培养24 h,与PBS对照组比较,100μg/mL nADPC组和200μg/mL nADPC组HSF(q=6.943、6.375,P<0.01)和HUVEC(q=6.301、6.496,P<0.01)增殖活力均明显下降;与100μg/mL nADPC组比较,200μg/mL nADPC组HSF和HUVEC增殖活力无明显变化(P>0.05)。划痕后24 h,与PBS对照组比较,单纯nADPC组、单纯lADPC组、单纯TNF-α组HSF和HUVEC迁移率均明显降低(q=5.642、6.645、11.480,4.772、6.298、10.420,P<0.05或P<0.01);与单纯nADPC组比较,单纯lADPC组HSF和HUVEC迁移率无明显变化(P>0.05);与单纯TNF-α组比较,TNF-α+nADPC组、TNF-α+lADPC组HSF迁移率无明显变化(P>0.05),HUVEC迁移率均明显升高(q=8.585、7.253,P<0.01);与TNF-α+nADPC组比较,TNF-α+lADPC组HSF和HUVEC迁移率无明显变化(P>0.05)。培养24 h,与PBS对照组比较,单纯nADPC组、单纯lADPC组、单纯TNF-α组HSF和HUVEC增殖活力均明显降低(q=5.803、5.371、9.136,11.580、9.493、13.510,P<0.05或P<0.01);与单纯nADPC组比较,单纯lADPC组HSF和HUVEC增殖活力均无明显变化(P>0.05);与单纯TNF-α组比较,TNF-α+nADPC组、TNF-α+lADPC组HSF(q=14.990、10.850,P<0.01)和HUVEC(q=7.066、8.942,P<0.01)增殖活力均明显升高;与TNF-α+nADPC组比较,TNF-α+lADPC组HSF和HUVEC增殖活力均无明显变化(P>0.05)。室温及冷凝状态下,lADPC-Bioink AG比Bioink AG外观稍显浑浊;三维生物打印且交联后lADPC-Bioink AG与Bioink AG形态类似。在10℃时,lADPC-Bioink AG的凝固时间为(76.6±0.4)s,明显慢于Bioink AG的(74.4±0.6)s(t=4.64,P<0.01)。治疗2 d,常规换药组裸鼠创面渗出较多,其余3组无明显渗出;治疗8 d,lADPC-Bioink AG组裸鼠残余创面面积最小,有明显上皮覆盖。治疗2 d,lADPC-Bioink AG组裸鼠创面愈合率明显高于单纯lADPC组(t=3.59,P<0.05),与常规换药组、单纯Bioink AG组相近(P>0.05);治疗6 d,lADPC-Bioink AG组裸鼠创面愈合率明显高于常规换药组、单纯lADPC组、单纯Bioink AG组(t=18.70、15.70、3.15,P<0.05或P<0.01);治疗10 d,lADPC-Bioink AG组裸鼠创面愈合率明显高于常规换药组、单纯lADPC组(t=12.51、4.84,P<0.01),与单纯Bioink AG组相近(P>0.05)。治疗10 d,lADPC-Bioink AG组裸鼠创面组织血管化程度适中,上皮化充分,愈合效果最好。结论抽脂术相关操作会降低ADPC蛋白浓度、提取效率等表征,但lADPC与nADPC具有相同的生物学作用,可在非炎症环境中抑制HSF与HUVEC的增殖与迁移能力,在炎症环境中提高HSF与HUVEC的增殖活力,同时提高HUVEC的迁移能力;将lADPC加入Bioink AG中后,不会明显影响Bioink AG的物理性质及打印性能,并可以提升裸鼠全层皮肤缺损创面的修复效果。