复合汗腺的组织工程三维皮肤模型的构建

目的:运用组织工程化方法在体外建立复合汗腺的三维皮肤模型,阐明汗腺体外再生的可行性,并为初步建立含有汗腺的仿生化功能性组织工程皮肤奠定实验基础。方法:分离培养人表皮细胞、成纤维细胞和汗腺细胞,将表皮细胞与汗腺细胞按1:1的比例共培养,在培养体系中分别加入含表皮细胞生长因子(EGF)的微球,噻唑蓝(MTT)法观察细胞增殖情况,并与培养时直接加入EGF及不加EGF的对照组进行比较。将共培养的细胞接种于复合成纤维细胞的胶原基质并通过三维培养方式构建组织工程皮肤模型,在模型中加入复合EGF的微球释放载体促进汗腺再生和上皮化进程,HE染色和免疫组织化学方法检测所构建组织工程皮肤以及体外再生汗腺的结构,并与模型中直接加入EGF和未加EGF的对照组进行比较。结果:MTT检测结果显示,与两对照组相比较,通过共培养方式获得的表皮与汗腺细胞团在复合EGF微球作用下生长良好,有明显增殖作用;组织学观察结果显示所构建组织工程皮肤模型具有和正常皮肤相似的结构,并在真皮浅层形成了类似汗腺结构的细胞密集区域,存在大量汗腺特异性标志--角蛋白19(CKl9)和癌胚抗原(CEA)阳性的细胞,这种现象在单纯EGF组仅有微弱表现,在空白对照组则无此现象出现。结论:构建具有汗腺结构的体外皮肤模型具有可行性,这为汗腺再生和功能性组织工程皮肤的研究开创了新的途径。

体外银屑病样三维皮肤模型的构建

目的通过应用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)和γ-干扰素(interferon-gamma,IFN-γ)联合诱导建立体外银屑病样三维皮肤模型,为银屑病发病机制及其治疗的研究提供理想的实验载体。方法从2~10岁男童包皮组织中分离出原代角质形成细胞(keratinocytes,KCs)和成纤维细胞(fibroblast,FBs)进行贴壁培养。常规传至2~3代后,FBs与Ⅰ型鼠尾胶原混合获得真皮类似物,然后将KCs接种到Transwell小室行气-液培养构建出正常三维皮肤模型。在正常三维皮肤模型气-液培养的最后4 d,每天在上室各加入7.5 ng/mL的TNF-α和IFN-γ以构建银屑病样三维皮肤模型。采用HE染色(hematoxylin-eosin staining,HE)观察模型组织病理学变化,免疫组织化学染色检测KCs的K17和Ki67表达,ELISA测定模型上清液中IL-17、IL-22、IL-23、ROS、MDA、SOD、GSH等水平。结果正常三维皮肤模型外观呈乳白色半透明状,边缘整齐;而银屑病样三维皮肤模型呈乳白色不透明状,边缘蜷曲,较正常皮肤模型明显增厚、缩小。组织病理学示,正常三维皮肤模型表皮层由1~3层整齐排列的KCs构成,真皮层见梭形FBs和胶原;银屑病样三维皮肤模型表皮厚度显著增加,真皮层由梭形FBs和红色胶原组成。免疫组织化学染色示:银屑病样三维皮肤模型表皮层细胞胞浆K17呈阳性表达,约70%胞核表达Ki67阳性;而正常三维皮肤模型表皮细胞几乎未见K17表达,仅少量细胞Ki67阳性。银屑病样三维皮肤的IL-17、IL-22、IL-23、ROS和MDA水平较正常三维皮肤显著升高(P<0.01),而SOD和GSH表达明显下降(P<0.01)。结论经TNF-α和IFN-γ干预正常三维皮肤模型后,可成功构建出银屑病样三维皮肤模型。该模型具有与人银屑病相似的形态学和分子生物学特征,为进一步研究银屑病的发病机制和药物的研发提供了理想的实验载体。

皮肤模型在化妆品功效评价中的应用研究进展

综述了三维重组皮肤模型及其在美白防晒、皮肤屏障、保湿抗衰、舒敏修复和大气污染防护领域中的研究与应用现状,分析了目前皮肤模型的优缺点,并对其未来的发展提出了建议。

三维重组皮肤模型在体外替代遗传毒性评价中的应用

三维(3D)重组皮肤模型已证实在模拟体内代谢条件、给药浓度及反应靶器官毒性特点方面具有突出优势。近年来已有多家公司构建3D重组人工皮肤模型,且一些制药公司已将3D细胞模型应用于药物的早期毒性筛选。我国动物实验替代方法的研究仍处于起步阶段,利用3D重组皮肤模型进行体外安全性评价成为目前替代方法的研究热点之一。综述人3D重组皮肤模型在遗传毒性评价中体外微核试验和彗星试验的研究进展,并对该模型在外用药物体外替代遗传毒性评价中的应用前景进行探讨。

Nrf2对体外三维皮肤光损伤模型的作用

目的探讨核转录相关因子E2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)对体外三维(threedimensional,3D)皮肤光损伤模型的保护作用,为光损伤发病机制及治疗途径提供实验依据。方法取儿童包皮分离、培养原代角质形成细胞(keratinocytes,KC)和成纤维细胞(fibroblasts,FBs)。以Ⅰ型胶原为基质混合包埋FBs,接种KC以构建正常体外3D皮肤模型。然后将3D皮肤模型分为3组:正常组、实验组和对照组。其中实验组在接种KC前,通过慢病毒转染方式使KC过表达Nrf2,再行3D皮肤模型的构建。除正常组外,实验组和对照组均予以UVA和UVB混合单剂量照射,照射后继续进行培养。24h后观察各组皮肤病理组织学改变、细胞凋亡情况及Nrf2,SOD,MDA等氧化应激相关指标的变化。结果正常3D皮肤呈乳白色皮肤类似物。组织病理学上表皮结构清晰,细胞排列整齐,核大圆深染;真皮为淡紫红色胶原基质,FBs散在分布;凋亡细胞少见。UV照射后,对照组表皮细胞排列紊乱、部分肿胀坏死,核浓缩,真皮胶原降解和FBs减少;凋亡细胞明显增加(P<0.05);Nrf2,SOD,GSH和CAT表达水平显著降低(P<0.05),而MDA和ROS水平明显升高(P<0.05)。但经过表达Nrf2后,实验组细胞整齐清晰,核无明显浓缩,KC轻度肿胀,FBs轻微减少,凋亡细胞显著减少(P<0.05);Nrf2,SOD,GSH和CAT水平升高(P<0.05),MDA和ROS降低(P<0.05)。结论体外构建的3D皮肤光损伤模型接近人皮肤光损伤,可作为一理想的光损伤模型进行推广;KC过表达Nrf2可减轻UV对体外3D皮肤的损伤。

真皮干细胞SKPs抗体外三维皮肤光损伤的作用

目的探讨真皮干细胞即皮肤前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)抗体外三维(three-dimensional,3D)皮肤光损伤的作用,为皮肤光损伤的治疗提供实验依据。方法按既往SKPs培养方法,采用悬浮培养法从新生小鼠真皮中分离、培养SKPs。同前期构建3D皮肤方法,以Ⅰ型胶原为支架,接种来自儿童包皮的原代培养的角质形成细胞(keratinocytes,KC)和成纤维细胞(fibroblasts,FBs)构建体外3D皮肤模型。然后将3D皮肤模型分为模型组、治疗组和对照组。在照射前24h,将SKPs细胞悬液和Hanks液各25μL分别注入治疗组和对照组,模型组未做处理。然后,予以UVA和UVB混合单剂量照射三组3D皮肤。照射后继续培养,72h后收集皮肤和上清液。HE染色观察各组皮肤组织病理学改变、TUNEL染色分析细胞凋亡情况以及ELISA检测SOD、CAT、MDA等氧化应激指标的变化。结果原代培养SKPs呈悬浮生长的圆形或椭圆形克隆样细胞球。3D皮肤经UV照射后,其表皮细胞肿胀排列紊乱、核浓缩,基底细胞部分液化变性,真皮胶原降解且FBs明显减少;凋亡细胞明显增加、凋亡指数AI值升高(P<0.05);SOD、CAT和GSHPx表达降低(P<0.05),而MDA水平升高(P<0.05)。但经SKPs注射后,KC整齐清晰仅轻度肿胀,核浓缩不明显,FBs轻微减少,未见细胞坏死及胶原降解;凋亡细胞显著减少、AI值下降(P<0.05);SOD、CAT和GSH-Px水平显著升高(P<0.05),MDA明显降低(P<0.05)。而对照组无明显改善。结论 SKPs能抗UV诱导的3D皮肤损伤,为皮肤光损伤的治疗奠定基础。