长链游离脂肪酸对滋养细胞线粒体三羟基酰基辅酶A脱氢酶基因启动子区甲基化程度的影响

目的 探讨长链游离脂肪酸对胎盘滋养细胞线粒体β氧化循环长链三羟基酰基辅酶A脱氢酶（LCHAD）基因启动子区甲基化程度影响,以及对甲基化修饰的时间效应.方法 体外培养原代人绒毛滋养细胞及HTR-8/SVneo永久性人滋养细胞,研究组采用长链游离脂肪酸孵育滋养细胞（LC-FFA组）,并以短链游离脂肪酸（SC-FFA组）和中链游离脂肪酸（MC-FFA组）作为不同链长游离脂肪酸对照组,空白对照组无脂肪酸（F-FFA组）.分别在孵育24、48及72 h收集细胞并提取DNA.在LCHAD基因转录起始位点上游2 000 bp区域内序列预测CpG岛位置,设计甲基化检测位点和引物.采用Sequenom MassArray甲基化DNA定量分析平台检测不同组CpG岛各CpG位点的甲基化程度后进行各甲基化位点和CpG岛的统计学分析.结果 （1）在LCHAD基因转录起始位点上游2 000bp区域内的17个CpG位点中获得11个位点（65％）的甲基化程度,8个为单独位点,3个为复合位点（-984、-960、-899、-853、-811、-796、-774、-727、-615、-595、-579）.在不同研究组中每个位点的甲基化变化程度各不同,其中-899位点变化最明显.（2）LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度变化分析：①长、中链游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度影响伴随时间的延长呈现升高趋势：LC-FFA组孵育72 h（0.55±0.08）比孵育48 h（0.35±0.12）及24 h（0.31±0.04）均明显升高（P＜0.05）,48 h虽比24 h升高,但差异无统计学意义（P＞0.05）.MC-FFA组孵育72 h（0.44±0.05）比孵育24 h（0.31±0.04）明显升高（P＜0.05）.②不同链长游离脂肪酸在不同作用时间影响LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度比较：LC-FFA组孵育72 h的甲基化程度比MC-FFA、SC-FFA组及F-FFA组的72、48及24 h均明显升高（P＜0.05）.（3）作用72 h游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区11个CpG位点甲基化程度影响比较：在LC-FFA组和MC-FFA组-899位点甲基化程度明显高于其他位点（P＜0.05）.（4）长链游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区-899位点甲基化程度影响伴随时间的延长呈现升高趋势（P＜0.05）.LC-FFA组孵育72 h比MC-FFA、SC-FFA组及F-FFA组的72、48及24 h均明显升高（P＜0.05）.结论 长链游离脂肪酸比中链和短链游离脂肪酸呈现较大的滋养细胞LCHAD基因启动子区甲基化的修饰作用,并伴随作用时间延长表现出明显的时间依赖效应;甲基化程度改变主要发生在LCHAD基因启动子区-899位点.

北京1200例汉族人群中长链脂肪酸氧化酶G1528C基因突变筛查

目的 :研究北京地区 12 0 0例汉族人群线粒体脂肪酸氧化代谢中的三功能蛋白酶 (mitochondrialtrifunc tionalprotein ,MTP)α亚单位的长链三羟基酰基辅酶A脱氢酶 (longchain 3 hydroxyacyl CoAdehydrogenase ,LCHAD)G15 2 8C基因的突变频率。方法 :应用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (polymerasechainreaction re strictedfragmentlengthpolymorphism ,PCR RFLP)技术分析 12 0 0例汉族正常产妇脐血MTP的α亚单位G15 2 8C基因突变携带情况。实验以西方人种的G15 2 8C杂合子标本为阳性对照 ,同时设立阴性和空白对照作为实验技术质控标准。结果 :12 0 0例汉族产妇脐血标本G15 2 8C基因经PCR RFLP突变筛查检测后 ,未见有与阳性对照标本相对分子质量相同的条带出现。结论 :中国人群与白种人之间可能存在着种族差异 ,西方人种中常见的MTPα亚单位的G15 2 8C基因突变可能不是中国人种中常见的突变位点。

妊娠期急性脂肪肝关键酶长链脂肪酸氧化酶编码基因突变在我国汉族人群中的表现

目的研究我国汉族人群患妊娠期急性脂肪肝(AFLP)的产妇及其新生儿线粒体脂肪酸氧化代谢中的线粒体三功能蛋白酶(MTP)ɑ亚单位的长链三羟基酰基辅酶A脱氢酶(LCHAD)G1528C及C1132T位点的突变情况。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)分析12组AFLP的产妇外周血和/或脐血/新生儿外周血MTPα亚单位编码基因中G1528C及C1132T位点的突变情况。结果 12组AFLP患者血标本MTPα亚单位的G1528C及C1132T位点经检测后,未见基因突变。结论西方人种患AFLP者中常见的MTPα亚单位的G1528C及C1132T位点突变可能不是中国人种AFLP患病的常见的突变位点,MTP缺陷存在种族差异。

长链脂肪酸氧化酶mRNA在正常妊娠及重度子痫前期胎盘中的表达

目的研究长链羟酰基辅酶A脱氢酶(long-chain3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenase,LCHAD)在正常妊娠不同孕期绒毛或胎盘组织的表达情况以及在伴有肝脏损害和不伴有肝脏损害重度子痫前期胎盘的表达差异。方法应用原位杂交和RT-PCR方法对早孕绒毛组织(10例)、妊娠中期胎盘组织(10例)、正常妊娠晚期胎盘组织(10例)及32例重度子痫前期胎盘组织进行LCHAD基因的定位表达及半定量测定。结果原位杂交实验显示正常妊娠早、中、晚期绒毛或胎盘组织及重度子痫前期胎盘组织滋养细胞中存在LCHAD阳性表达。RT-PCR实验显示①妊娠早期绒毛LCHAD表达与妊娠中期比较,P=0.844;妊娠早期绒毛LCHAD表达高于晚期胎盘,P=0.020;妊娠中期胎盘LCHAD表达也高于晚期胎盘P=0.026;②发病孕周≤34周早发型重度子痫前期伴肝损害胎盘组织中LCHAD表达均值为(0.449±0.038),不伴肝损害LCHAD表达均值为(0.482±0.042),伴肝损害较不伴肝损害者表达有减弱,但两组比较,P=0.084;发病孕周≤34周早发型重度子痫前期伴肝损害LCHAD表达量与正常晚期比较,P=0.05,而不伴肝损害重度子痫前期LCHAD表达量与正常晚期比较,P=0.775。结论本研究显示在妊娠的早中晚期滋养细胞中均存在长链脂肪酸氧化代谢,妊娠早中期LCHAD的mRNA表达高于妊娠晚期;早发型重度子痫前期伴肝损害胎盘组织中LCHAD表达均值与不伴有肝损害者比较虽无统计学差异,但是有明显降低趋势。提示长链脂肪酸氧化代谢对子痫前期伴发肝脏损害的影响还有待酶活性和蛋白水平以及代谢调节方面的深入研究。

Notch家族蛋白、LCHAD在早发型重度子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义

目的探讨Notch家族蛋白、长链三羟基酰基辅酶A脱氢酶(LCHAD)的表达与早发型重度子痫前期发病的关系,揭示早发型重度子痫前期发病机理。方法选择早发型重度子痫前期患者45例、晚发型重度子痫前期患者42例为研究组,40例正常分娩者为对照组,免疫组化法检测Notch家族蛋白、LCHAD在胎盘绒毛组织中的分布和表达水平。结果各组胎盘组织的合体滋养细胞、血管内皮细胞、蜕膜细胞中均可以检测到Notch家族蛋白、LCHAD的表达。早发型重度子痫前期组Notch家族蛋白、LCHAD表达均显著低于晚发型重度子痫前期组及对照组。各组胎盘组织中Notch家族蛋白表达与LCHAD表达水平呈正相关。结论早发型重度子痫前期组胎盘中Notch家族蛋白、LCHAD低表达与疾病的发病发展密切相关。二者通过影响滋养细胞浸润,胎盘浅着床在早发型重度子痫前期发生发展中起重要作用。