组氨酸三联体核苷酸结合蛋白2通过调控巨噬细胞焦亡抑制动脉粥样硬化

目的:探讨组氨酸三联体核苷酸结合蛋白2(HINT2)对动脉粥样硬化(AS)的影响及其可能机制。方法:分离胸痛患者的外周血单个核细胞(PBMCs)并诱导分化为巨噬细胞,检测细胞中HINT2的表达水平。体外培养RAW264.7小鼠巨噬细胞,检测细胞上清液炎症因子的水平及细胞死亡情况。建立载脂蛋白E基因敲除(apoE^(−/−))小鼠AS模型,检测小鼠主动脉根部斑块形成及巨噬细胞的脂质代谢和泡沫化程度。RT-qPCR和Western blot法检测RAW264.7细胞和apoE^(−/−)小鼠主动脉内焦亡相关因子的表达水平。结果:急性冠脉综合征患者PBMCs源性巨噬细胞中HINT2的表达水平显著降低,且与血清中促炎因子水平呈负相关,与抗炎因子水平呈正相关,提示HINT2可能抑制AS的炎症反应。体外实验结果表明,过表达HINT2基因能够抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激下巨噬细胞的脂质积累和泡沫化,降低细胞上清中白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、IL-18和肿瘤坏死因子α等炎症因子的分泌,减少细胞死亡和焦亡相关因子的mRNA及蛋白表达。动物实验结果表明,过表达HINT2基因能够减轻apoE^(−/−)小鼠主动脉根部的斑块负荷,降低巨噬细胞的泡沫化程度,抑制焦亡相关因子核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、caspase-1、消皮素D(GSDMD)、IL-1β和IL-18的mRNA及蛋白表达。结论:HINT2可以抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡,减轻AS过程中的炎症反应,减缓AS的发生与发展。

三联组氨酸核苷酸结合蛋白2对结肠癌细胞SW620侵袭迁移的影响

目的 观察上调三联组氨酸核苷酸结合蛋白2（Hint2）表达对结肠癌细胞SW620侵袭迁移能力的影响,探讨Hint2表达调控SW620侵袭迁移的可能机制.方法 用慢病毒pLVX-IRES-ZsGreen1-Hint2载体转染293T后构建Hint2过表达SW620^Hint2＋细胞株;Western blot检测细胞Hint2的表达水平,Transwell侵袭迁移实验以及划痕实验检测结肠癌细胞侵袭数目和迁移距离,分析其与Hint2表达的关系.结果 成功构建Hint2过表达的SW620^Hint2＋细胞;SW620^Hint2＋组细胞Hint2蛋白表达量为SW620组的3.1倍;SW620^Hint2＋组穿透基质胶的细胞数显著少于SW620组[（52.33±5.05）％比（112.83±10.11）％,P＜0.05].SW620^Hint2＋组迁移的细胞数显著少于SW620组[（51.17±11.64）％比（111.17 ±11.64）％,P＜0.05].划痕实验24 h后SW620^Hint2＋组细胞迁移的平均距离显著短于SW620组[（0.37 ±0.03） mm比（0.71±0.04）mm,P＜0.05].细胞Hint2的表达水平与其侵袭及迁移能力呈负相关（r=-1.000,P＜0.01）.结论 成功构建后的SW620^Hint2＋细胞株稳定过表达Hint2,其侵袭及迁移的能力明显下降,由此提示Hint2的上调可能参与结肠癌细胞转移和迁移能力的负性调控。

三联组氨酸核苷酸结合蛋白1与人类疾病

三联组氨酸核苷酸结合蛋白1(HINT1)是三联组氨酸蛋白超家族成员之一,三联组氨酸因为具有保守的核苷酸结合基序组氨酸-x-组氨酸-x-组氨酸-xx(x代表1个疏水氨基酸)而得名,HINT1广泛参与肿瘤、神经精神疾病等人类疾病的病理生理过程。本文主要综述HINT1的结构、分布、酶活性基本功能,以及与人类疾病的关联。

2型糖尿病患者血清微小RNA-155和核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3水平变化及对颈动脉粥样硬化的诊断价值

目的探讨血清微小RNA(miR)-155、核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3(NLRP3)水平变化及其对2型糖尿病(T_(2)DM)患者颈动脉粥样硬化(CAS)的诊断价值。方法选取2021年1月至2023年1月四川大学华西医院收治的T_(2)DM患者142例。根据是否存在CAS分为CAS组(72例)和非CAS组(70例)。收集和比较2组患者的一般资料,检测和比较2组患者血清miR-155和NLRP3水平。采用Pearson相关性分析方法分析T_(2)DM患者血清miR-155与NLRP3水平的相关性。采用多因素Logistic回归方法分析T_(2)DM患者CAS的影响因素。采用受试者工作特征曲线分析血清miR-155、NLRP3水平对T_(2)DM患者CAS的诊断价值。结果CAS组T_(2)DM病程长于非CAS组,吸烟史比例、糖化血红蛋白、稳态模型胰岛素抵抗指数、miR-155、NLRP3均高于非CAS组(均P<0.05)。Pearson相关性分析显示T_(2)DM患者血清miR-155与NLRP3水平呈正相关(r=0.765,P<0.001)。多因素Logistic回归模型结果显示T_(2)DM病程延长、吸烟史和糖化血红蛋白、稳态模型胰岛素抵抗指数、miR-155、NLRP3升高是影响T_(2)DM患者CAS的独立危险因素(均P<0.05)。受试者工作特征曲线分析显示血清miR-155、NLRP3水平二者联合诊断T_(2)DM患者CAS的曲线下面积大于血清miR-155、NLRP3水平单独诊断(0.900比0.791、0.799,Z=3.436、3.381,均P=0.001)。结论血清miR-155、NLRP3水平升高与T_(2)DM患者CAS发生密切相关,血清miR-155、NLRP3水平联合对T_(2)DM患者CAS的诊断价值较高。

氧化损伤对视网膜色素上皮细胞三联组氨酸核苷结合蛋白1(HINT1)表达的影响

目的探讨过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)诱导人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞氧化损伤对三联组氨酸核苷结合蛋白1(histidine triad nucleotide binding protein 1,HINT1)表达的影响。方法将人ARPE-19细胞系分别用0μmol·L^(-1)H_2O_2(对照组)、50μmol·L^(-1)H_2O_2、100μmol·L^(-1)H_2O_2、200μmol·L^(-1)H_2O_2、400μmol·L^(-1)H_2O_2、600μmol·L^(-1)H_2O_26个浓度梯度处理。采用Live/Dead荧光双染法和MTT法分别检测细胞活力和增殖能力;采用Western blot检测RPE细胞内BAX、BCL-2以及HINT1的表达水平。结果 H_2O_2处理6 h后,对照组及50μmol·L^(-1)、100μmol·L^(-1)、200μmol·L^(-1)、400μmol·L^(-1)及600μmol·L^(-1)H_2O_2组RPE细胞死亡率分别为(0. 35±0. 11)%、(2. 03±0. 87)%、(3. 76±1. 41)%、(12. 17±1. 26)%、(17. 69±2. 24)%、(25. 22±0. 59)%,RPE细胞死亡率呈剂量依赖性升高(P <0. 05)。H_2O_2作用后对照组及50μmol·L^(-1)、100μmol·L^(-1)、200μmol·L^(-1)、400μmol·L^(-1)、600μmol·L^(-1)H_2O_2组RPE细胞生存率分别为(40. 72±2. 71)%、(37. 75±0. 62)%、(35. 30±0. 68)%、(34. 10±0. 74)%、(33. 61±0. 71)%、(31. 05±1. 41)%,RPE细胞增殖明显减少(P <0. 05),具有剂量-效应关系。随着H_2O_2浓度的增加,BAX蛋白表达逐渐上升(P <0. 01),而抗凋亡BCL-2蛋白表达则逐渐下降(P <0. 01),BAX/BCL-2比值相比对照组分别升高1. 85倍(50μmol·L^(-1)H_2O_2组)、2. 35倍(100μmol·L^(-1)H_2O_2组)、2. 86倍(200μmol·L^(-1)H_2O_2组)、3. 97倍(400μmol·L^(-1)H_2O_2组)、8. 50倍(600μmol·L^(-1)H_2O_2组); HINT1在H_2O_2处理的RPE细胞中以剂量依赖性方式逐渐下降(P <0. 01),分别下降0. 78倍(50μmol·L^(-1)H_2O_2组)、0. 59倍(100μmol·L^(-1)H_2O_2组)、0. 45倍(200μmol·L^(-1)H_2O_2组)、0. 42倍(400μmol·L^(-1)H_2O_2组)、0. 38倍(600μmol·L^(-1)H_2O_2组)。结论 H_2O_2氧化损伤诱导RPE细胞活力显著减弱,细胞凋亡相关蛋白BAX表达升高;同时,细胞中HINT1表达下调,表明HINT1可能通过影响细胞凋亡参与年龄相关性黄斑变性的发生,为其药物作用的潜在靶点。

三联组氨酸核苷结合蛋白1及其在神经精神疾病中的功能

三联组氨酸核苷结合蛋白1(HINT1)是三联组氨酸(HIT)酶家族成员,作为核苷水解酶或转移酶起作用,其生物学功能尚不清楚。HINT1蛋白可在多种组织中表达,在转录和信号转导中发挥重要作用。早期研究已经明确HINT1是单倍剂量不足的肿瘤抑制因子;也有研究表明HINT1广泛参与一系列生理过程,且部分功能与其基本的酶活性无关;新近研究表明这一蛋白与诸多外周、中枢神经系统疾病存在密切关系,在遗传性周围神经病、精神分裂症、心境障碍、药物成瘾、唐氏综合征等神经精神疾病中起作用。本文针对HINT1蛋白在以上不同神经精神疾病中的作用做了详细综述,分析归纳了HINT1在上述每一种疾病中的研究发现,以期对今后该蛋白的深入研究起到一定的指导作用。

ghrelin对脓毒血症大鼠肺脏炎症及核苷酸结合寡聚域2和受体相互作用蛋白2 mRNA表达的影响

目的研究ghrelin对脓毒血症大鼠肺脏中性粒细胞浸润、炎性细胞因子[肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6]及核苷酸结合寡聚域2(NOD2)和受体相互作用蛋白2(RIP2)mRNA表达的影响。方法 24只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4组:假手术组(Sham组)、假手术+ghrelin组(Sham+ghrelin组)、脓毒血症组(CLP组)和脓毒血症+ghrelin组(CLP+ghrelin组)。采用盲肠结扎穿孔(CLP)的方法建立脓毒血症大鼠模型。Sham+ghrelin组和CLP+ghrelin组分别于假手术或CLP后即刻经尾静脉注射10 nmol/kgghrelin,Sham组和CLP组于相应时间点尾静脉注射等量0.9%氯化钠溶液,给药速率为0.2 mL/min。于假手术或CLP后6 h麻醉下处死大鼠,取肺组织,光学显微镜下观察肺组织病理学变化,并测定髓过氧化物酶(MPO)活性、TNF-α和IL-6水平以及NOD2和RIP2 mRNA的表达。结果与Sham组和Sham+ghrelin组比较,CLP组和CLP+ghrelin组肺组织MPO活性、TNF-α和IL-6水平、NOD2和RIP2 mRNA的表达均显著升高(P值均<0.05);CLP+ghrelin组肺组织MPO活性、TNFα-和IL-6水平、NOD2和RIP2 mRNA的表达均显著低于CLP组(P值均<0.05)。结论 ghrelin可改善脓毒血症大鼠肺脏中性粒细胞的浸润、下调肺组织炎性细胞因子(TNF-α和IL-6)的表达,其作用可能与抑制NOD2/RIP2信号通路有关。

血清脂蛋白相关磷脂酶A2、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3与老年冠心病Syntax积分的相关性

目的探讨血清核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA_(2))与老年冠心病患者Syntax积分的相关性。方法选取2018年1月至2020年4月濮阳市人民医院收治的114例冠心病患者作为观察组,再选取同期在濮阳市人民医院接受体检的108例健康者作为对照组。比较两组血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平,比较Syntax积分及主要不良心血管事件(MACE)发生情况,比较不同Syntax积分及不同MACE发生情况患者的血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平,分析血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平与Syntax积分的相关性以及血清NLRP3、Lp-PLA_(2)联合检测对发生MACE的预测价值。结果观察组血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平高于对照组(P<0.05)。随着Syntax积分升高,血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平逐渐升高(P<0.05);血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平与Syntax积分呈正相关(P<0.05);发生MACE患者血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平高于对照组(P<0.05);ROC曲线显示血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平联合检测的AUC值大于任意单一检测(P<0.05)。结论冠心病患者血清NLRP3、Lp-PLA_(2)水平升高,其水平与病变严重程度密切相关。通过检测NLRP3、Lp-PLA_(2)水平可预测冠心病患者MACE的发生风险。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性体在2型糖尿病并发冠心病过程中的作用

目的探究核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎性体在2型糖尿病并发冠心病过程中的作用。方法选取第三军医大学新桥医院心血管内科的住院患者共130例,分为单纯冠心病组(n=40)、单纯2型糖尿病组(n=20)、2型糖尿病并发冠心病组(n=40)及正常对照组(n=30)。分离外周血单个核细胞及血浆。采用RT-q PCR、Western blot分别检测各组外周血单个核细胞中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosisassociated speck-like protein,ASC)、半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)mRNA及蛋白表达情况,ELISA法检测各组血浆中IL-1β含量。结果单纯冠心病组、单纯2型糖尿病组及2型糖尿病并发冠心病组外周血单个核细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均较正常对照组显著增高(P<0.05),其中,2型糖尿病并发冠心病组ASC、Caspase-1 mRNA在外周血单个核细胞中的表达显著高于单纯冠心病组及单纯2型糖尿病组(P<0.05),而2型糖尿病并发冠心病组NLRP3蛋白在外周血单个核细胞中的表达显著高于单纯冠心病组及单纯2型糖尿病组(P<0.05)。同时,测得单纯冠心病组、单纯2型糖尿病组及2型糖尿病并发冠心病组血浆中IL-1β含量分别为(24.05±1.00)、(22.86±1.66)、(26.85±1.45)ng/L,较正常对照组(12.53±2.79)ng/L均显著升高(P<0.05),其中,2型糖尿病并发冠心病组血浆中IL-1β含量显著高于单纯冠心病组及单纯2型糖尿病组(P<0.05)。结论 NLRP3炎性体的异常激活可促进2型糖尿病并发冠心病病理过程的发生、发展,其可能成为防治2型糖尿病并发冠心病的新靶点。

硒半胱氨酸插入序列结合蛋白2基因rs3211703多态性与缺血性中风血瘀证及气虚证显著关联

目的探讨硒半胱氨酸插入序列结合蛋白2(SECISBP2,SBP2)基因rs3211703多态性与缺血性中风(IS)中医证型的关联性。方法共纳入汉族缺血性中风患者774例,正常对照793例。采用《中风病辨证诊断标准》对IS患者进行中医辨证。运用MassARRAY SNP基因分型技术进行基因分型检测。采用PLINK软件进行遗传关联分析。结果SECISBP2基因rs3211703多态性与缺血性中风血瘀证[加性模型:OR(95%CI)=1.36(1.06~1.74),P=0.015;显性模型:OR(95%CI)=1.45(1.04~2.01),P=0.028;等位模型:OR(95%CI)=1.38(1.07~1.77),P=0.013]、气虚证发生风险均显著关联[显性模型:OR(95%CI)=1.72(1.10~2.68),P=0.018;等位模型:OR(95%CI)=1.40(1.00~1.95),P=0.048];校正年龄、性别后,SECISBP2基因rs3211703多态性与缺血性中风血瘀证[加性模型:ORadj(95%CI)=1.36(1.06~1.74),Padj=0.014;显性模型:ORadj(95%CI)=1.45(1.04~2.02),Padj=0.027]、气虚证[显性模型:ORadj(95%CI)=1.69(1.08~2.65),Padj=0.021]发生风险的关联仍具有统计学意义。结论SECISBP2基因rs3211703多态性可能影响中国汉族人缺血性中风血瘀证及气虚证的发生。

Kruppel样因子15通过调控核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3表达影响胰岛素抵抗实验研究

目的:探讨Kruppel样因子15(KLF15)是否通过调控核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)表达影响胰岛素抵抗。方法:建立小鼠模型和细胞模型,细胞蛋白电泳检测细胞内目的蛋白表达,聚合酶链反应(PCR)检测KLF15表达量,Western blot检测NLRP3相对表达量,免疫组化法检测组织KLF15表达,免疫荧光染色检测细胞增殖相关蛋白。结果:在链脲佐菌素(STZ)诱导小鼠模型中,小鼠诱导后1~4个月,血清KLF15 mRNA表达量水平被抑制。用10、20、40 mmol/L葡萄糖诱导HepG2细胞24 h后,细胞内KLF15 mRNA表达量水平随葡萄糖浓度升高而减少(均P<0.05)。小鼠组织中,KLF15、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、胰岛素受体底物1(IRS1)在空白组表达最高,其次分别为1、2、4个月组;NLRP3在空白组表达最低,1、2、4个月组依次升高(均P<0.05)。在体外模型中,si-NLRP3质粒可以降低NLRP3表达量;抑制NLRP3表达可以减少干扰素-γ(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β表达,同时增加IRS1、GLUT4表达量;NLRP3过表达质粒可以促进NLRP3表达量,过表达NLRP3可以促进INF-γ、TNF-α、IL-6和IL-1β表达,同时减少IRS1、GLUT4表达量;上调KLF15可以抑制NLRP3蛋白表达,抑制KLF15可以促进NLRP3蛋白表达(均P<0.05)。结论:KLF15表达量与2型糖尿病(T2DM)胰岛素抵抗有关,KLF15低表达量可能会增加胰岛素抵抗。KLF15可能通过抑制NLRP3表达量减少T2DM胰岛素的炎症水平,抑制胰岛素抵抗。KLF15可能为胰岛素抵抗的T2DM的潜在治疗和诊断靶点,为以后的相关研究提供实验依据。

HER-2寡脱氧核苷酸-叶酸药物的生物学特性

目的研究HER-2寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)与叶酸连接药物的生物学特性。方法 HER-2反义、正义和无义寡脱氧核苷酸与叶酸联接,形成ODN-FA,标记放射性核素锝(99mTc),与新鲜人血浆孵育1．5h、4h和6h,测定血浆蛋白结合率。在新鲜人血清37℃孵育 0．5h、2h、4h和6h,用纸层析法测定血清稳定性。结果 99mTc-ODN-FA的血浆蛋白结合率为反义、正义和无意义寡核苷酸分别为10．58％、12．24％和11．01％;6h血浆蛋白结合率明显升高,分别为 24．45％、23．58％和24．33％,差异具有显著意义(P<0．01)。99mTc-ASODN-FA、99mTc-SODN-FA和 99mTc-NODN-FA 6h放化纯分别为92．20％、92．12％和91．31％,与0．5 h相比略有降低,差异无显著意义。结论 HER-2寡脱氧核苷酸叶酸药物的血浆蛋白结合率6h时为24％,在血清中6h内稳定,能够满足体内外分析的要求。

α-硫辛酸对2型糖尿病胰岛素抵抗的机制研究

目的观察α-硫辛酸调控核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体对2型糖尿病(T2DM)胰岛素抵抗的机制。方法选取南京中医药大学附属南京医院(南京市第二医院)2021年6月至2023年6月就诊的102例T2DM患者研究,在组间基线特征可比的原则上,以随机数字表法将其分为基础组和观察组,各51例。基础组给予基础降糖治疗,观察组在基础组基础上给予α-硫辛酸治疗,比较两组患者血糖指标、血脂指标、血清NLRP3及下游炎性因子、胰岛素抵抗指标。结果观察组患者治疗后糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2hPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血清NLRP3、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-1β(IL-1β)、稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)均低于基础组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组患者治疗后高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和稳态模型胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)高于基础组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论α-硫辛酸通过下调T2DM患者NLRP3及下游炎性因子,可改善胰岛素抵抗,降低血糖、血脂,效果显著。

RNA结合蛋白NONO通过影响SKP2、E2F8表达调控乳腺癌细胞增殖的研究

目的探讨不含POU结构域的八聚体核苷酸结合蛋白(NONO)是否通过影响S期激酶相关蛋白2(SKP2)和E2F转录因子8(E2F8)表达从而调控乳腺癌细胞增殖。方法收集2019年6月至2020年6月于该院接受乳腺癌根治术治疗的43例乳腺癌患者的乳腺癌组织及癌旁组织石蜡块。采用免疫组织化学SP染色检测NONO、SKP2和E2F8在组织中的表达。将MCF-7细胞分为MCF-7组(无特殊处理)、sh-NC-MCF-7组(加入sh-NC序列正义链的慢病毒LV3液)和sh-NONO-MCF-7组(加入含sh-NONO序列正义链的慢病毒LV3液)。检测sh-NONO的沉默效率,筛选稳定株。分析沉默NONO对乳腺癌细胞增殖能力、细胞周期以及SKP2和E2F8表达的影响。结果乳腺癌组织中NONO、SKP2和E2F8阳性表达率显著高于癌旁组织(P<0.05);与MCF-7和sh-NC-MCF-7组比较,sh-NONO-MCF-7组NONO蛋白表达水平降低(P<0.05),提示成功构建NONO沉默MCF-7细胞株;与MCF-7和sh-NC-MCF-7组比较,sh-NONO-MCF-7组增殖能力降低(P<0.05);与MCF-7和sh-NC-MCF-7组比较,sh-NONO-MCF-7组G_(0)/G_(1)期细胞比例显著增加,S期和G_(2)/M期细胞比例显著降低(P<0.05);与MCF-7和sh-NC-MCF-7组比较,sh-NONO-MCF-7组SKP2和E2F8蛋白表达水平以及SKP2和E2F8 mRNA相对表达水平均显著降低(P<0.05)。结论沉默NONO表达可通过下调SKP2和E2F8表达,诱导细胞周期阻滞,从而抑制乳腺癌细胞增殖。

NOD2致高同型半胱氨酸血症小鼠心室重构的作用及其机制

目的探讨细胞内模式识别受体——核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)蛋白家族中NOD2蛋白在高同型半胱氨酸血症(hHcys)心肌组织的表达及致心室重构的作用。方法选取野生雄性(WT)小鼠、胱硫醚β合酶(CBS)^+/-鼠(CBS敲基因鼠)、NOD2^-/-鼠(NOD2敲基因鼠)各20只,分别再分为正常饮食、无叶酸饮食各10只,无叶酸饮食建立hHcys小鼠模型。实时荧光定量PCR检测正常饮食、无叶酸饮食小鼠心肌组织NOD2mRNA表达水平,Westernblotting测定心肌组织NOD2蛋白及MMP-9蛋白表达水平,小动物超声心动图测定心室重构指标并判断心功能。结果与正常饮食组相比,NOD2在无叶酸饮食的WT小鼠和CBS^+/-小鼠心肌组织中mRNA水平和蛋白表达水平明显升高(P均<0.05);超声心动图发现NOD2基因缺失hHcys小鼠左室肥大和室壁变薄减轻,心功能也得到不同程度的改善(P均<0.05);NOD2基因缺失小鼠心肌组织MMP-9蛋白表达降低(P<0.05)。结论NOD2在hHcys小鼠心肌组织中高表达,NOD2通过调控MMP-9的表达参与hHcys所致心室重构过程。

三联组氨酸核苷酸结合蛋白1在食管癌中的表达及机制

目的探讨三联组氨酸核苷酸结合蛋白1在食管癌中的表达及机制.方法选择Eca-109食道癌细胞株实验室细胞培养,用pLVX-IRES-ZsCreen1慢病毒表达Hint1载体,感染293T细胞纯化浓缩后,感染Eca-109细胞得到Eca-109^Hint1+组细胞;测定两组细胞绿色荧光蛋白的表达,检测转染是否成功;用蛋白质印迹法(Western blot)法检测细胞Hint1蛋白的表达;用Transwell侵袭实验检测不同组细胞的侵袭能力;用流式细胞仪检测细胞周期;用噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长情况.结果Eca-109Hint1+组细胞中荧光蛋白平均表达率(68.26±3.12)%,而对照组细胞未见绿色荧光表达(t=8.250,P<0.01);Western blot法检测Eca-109^Hint1+组细胞中Hint1表达为(1.86±0.02),而Eca-109组细胞中Hint1表达为(0.61±0.01,t=5.529,P<0.05);Eca-109^Hint1+组细胞的侵袭能力为(49.36±3.02),而Eca-109组细胞侵袭能力为(114.11±10.01),Eca-109^Hint1+组细胞的侵袭能力低于Eca-109组细胞的侵袭能力(t=8.988,P<0.05);Eca-109组细胞细胞周期为(50.31±0.41),Eca-109^Hint1+组细胞的细胞周期为(41.24±0.62);MTT实验显示Eca-109^Hint1+组细胞的吸光度(A)值为(0.82±0.01),Eca-109组细胞的A值为(0.57±0.02),Eca-109^Hint1+组细胞的A值高于Eca-109组细胞的A值(t=6.527,P<0.05).结论三联组氨酸核苷酸结合蛋白1在食管癌中的表达时,细胞周期变长,细胞活力增加,对于食管癌细胞具有抑制作用.

胞质蛋白NOD2重组腺病毒载体的构建

目的构建人NOD2腺病毒表达载体。方法采用分子克隆技术，从CoCa2细胞DNA中PCR扩增NOD2片段，经pcDNA3．1克隆到穿梭质粒pShuttle—CMV，以KpnⅠ和NotⅠ双酶切重组穿梭质粒，经电穿孔、抗性筛选，重组成pAdCMV-NOD2腺病毒质粒，经酶切鉴定正确后，在HEK293细胞中包装成为重组rvAdCMV-NOD2腺病毒，并进行PCR鉴定测定。结果成功扩增目的基因并鉴定，重组穿梭质粒pShuttle-CMV-NOD2鉴定，经酶切鉴定证实重组腺病毒质粒构建成功。结论腺病毒载体应用广泛，细菌体内同源重组腺病毒pAdCMV-NOD2合成效率高，为炎症的基因治疗研究奠定基础。

五味子乙素预处理对过氧化氢诱导的H9c2细胞焦亡及TXNIP/NLRP3/Caspase-1通路的影响

目的基于硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)通路观察五味子乙素对过氧化氢(H 2O 2)诱导的大鼠H9c2心肌细胞氧化损伤及焦亡的影响,探讨五味子乙素的心肌保护作用机制。方法体外培养H9c2心肌细胞,实验设4组:正常组细胞常规孵育,五味子乙素组细胞加入40μmol/L五味子乙素孵育24 h,H 2O 2组细胞加入1000μmol/L的H 2O 2孵育30 min,H 2O 2+五味子乙素组细胞加入40μmol/L五味子乙素孵育24 h后再加入H 2O 2孵育30 min。CCK-8法检测细胞活力,DCFH-DA探针检测细胞中活性氧(ROS)含量,试剂盒检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量和细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量,Western blot法检测细胞中TXNIP、硫氧还蛋白(Trx)、NLRP3、裂解的半胱氨酸蛋白酶-1(Cleaved Caspase-1)、消皮素D(GSDMD)-N蛋白表达情况,ELISA法检测细胞培养上清中白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-1β(IL-1β)含量。结果与正常组比较,H 2O 2组细胞活力明显下降(P<0.05),细胞中ROS、MDA含量和TXNIP、NLRP3、Cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白相对表达量及细胞培养上清中LDH、IL-1β、IL-18含量均明显升高(P均<0.05),细胞中SOD、GSH-Px含量和Trx蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05);与H 2O 2组比较,H 2O 2+五味子乙素组的细胞活力明显升高(P<0.05),细胞中ROS、MDA含量和TXNIP、NLRP3、Cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白相对表达量及细胞培养上清中LDH、IL-1β、IL-18含量均明显降低(P均<0.05),细胞中SOD、GSH-Px含量和Trx蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。结论五味子乙素可能通过影响TXNIP/NLRP3/Caspase-1通路,从而减轻H 2O 2诱导的H9c2细胞氧化损伤,抑制心肌细胞焦亡。

基于NOD2介导的AMPK/mTOR信号通路探讨宫颈癌细胞恶性行为的机制

目的 基于核苷酸结合寡聚化结构域受体2(NOD2)介导的AMP活化蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路探讨宫颈癌(CC)细胞恶性行为的机制。方法 生物信息学分析确定NOD2在CC组织中的表达。将靶向NOD2(shNOD2)、shRNAs阴性对照(shNC)以及NOD2过表达(NOD2)质粒和载体(Vec)转染CC细胞。通过CCK-8测定、集落形成和Transwell细胞侵袭测定来确定NOD2对CC细胞生长的影响。通过高通量RNA测序(RNA-Seq)进行转录组分析。Western blot试验检测细胞系中NOD2、AMPK/mTOR信号通路和自噬蛋白的表达。24只雌性BALB/c裸鼠随机分为4组,每组6只:载体组(Vec组)、NOD2过表达组(NOD2组)、shNC组和shNOD2组。构建小鼠远处转移模型,监测肺转移的荧光强度,计数肺转移结节的数量。结果 在线数据库分析显示,NOD2在CC组织中表达明显高于正常组织,并且不同分期的CC中NOD2的mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。此外,NOD2的高表达与较差的总生存期和无病生存期相关(P<0.05)。NOD2过表达对CC细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭具有促进作用,而NOD2敲低则相反。与体外结果一致,在转移的小鼠尾静脉注射模型中,NOD2组CC细胞的肺定殖、肺转移灶较Vec组增加(P<0.05),而shNOD2组CC细胞的肺定殖、肺转移灶较shNC组减少(P<0.05)。RNA-Seq结果显示NOD2表达与AMPK信号激活、mTOR信号抑制、自噬调节途径激活和自噬体形成显著相关。与shNC组相比,shNOD2组磷酸化AMPK、LC3蛋白表达水平减少(P<0.05),磷酸化mTOR、p62蛋白表达水平增加(P<0.05);与Vec组相比,NOD2组LC3、AMPK蛋白表达水平增加(P<0.05),磷酸化mTOR、p62蛋白表达水平减少(P<0.05)。与shNC组相比,shNOD2组GFP-mRFP-LC3的点积累减少(P<0.05);与Vec组相比,GFP-mRFP-LC3的点积累增加(P<0.05)。结论 NOD2可能通过AMPK/mTOR信号促进CC增殖、迁移和侵袭,其作用机制部分涉及自噬激活。

浸润性乳腺癌组织肝配蛋白A型受体2(EphA2)高表达且与细胞焦亡负相关

目的探讨肝配蛋白A型受体2(EphA2)参与浸润性乳腺癌中细胞焦亡(pyroptosis)的机制。方法采用Western blot法检验乳腺癌患者癌组织、癌旁组织和正常乳腺组织EphA2、含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、白细胞介素1β(IL-1β)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的蛋白表达水平;采用免疫荧光技术检测45例乳腺癌患者癌组织和癌旁组织中EphA2表达情况;用Pearson相关系数对患者癌组织EphA2的蛋白表达与细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β进行相关性分析。结果与正常乳腺组织及癌旁组织相比,乳腺癌组中NLRP3、caspase-1、IL-1β和ICAM-1的蛋白表达水平明显降低,EphA2蛋白表达明显升高;EphA2水平与细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β均呈负相关性。结论乳腺癌组织EphA2高表达,且与细胞焦亡呈负相关。