胸膜肺炎放线杆菌三聚体自转运黏附素功能区的表达及黏附活性

试验对三聚体自转运黏附素(TAAs)的重要功能区第1 703～2 018氨基酸残基区域进行原核表达,并利用激光共聚焦显微镜观察重组蛋白在猪肺上皮细胞的结合部位,通过黏附抑制试验研究该蛋白的生物活性。结果显示,扩增的adh4基因片段与GenBank中相应的基因序列的同源性达100%,表达得到相对分子质量约为31 000的Adh4蛋白,该蛋白能够黏附在猪肺上皮细胞膜表面。猪肺上皮细胞经Adh4蛋白处理后,降低了APP对它的黏附能力,同时Adh4抗体可以抑制该菌对细胞的黏附,黏附菌数与其稀释度呈负相关。结果表明,Adh4蛋白可以介导APP对猪肺上皮细胞的黏附作用,进一步证明了位于N端1703～2018氨基酸残基区域是三聚体自转运黏附素蛋白的功能区,为研究胸膜肺炎放线杆菌的黏附机制奠定了基础。

胸膜肺炎放线杆菌三聚体自转运黏附素茎部功能区表达及其与猪肺组织结合蛋白的筛选分析

【目的】胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)可引发猪的传染性胸膜肺炎,给世界养猪业造成了巨大损失。黏附是APP在致病过程中的第一步,新型黏附分子——三聚体自转运黏附素(Trimeric autotransporter adhesin,TAA)是该菌感染肺组织的重要毒力因子,茎部区2 464-2 574氨基酸(BD3)序列区域在细菌的黏附中发挥重要作用,但其如何结合肺脏组织尚属未知。本文表达TAA的茎部功能区,筛选其在肺组织中的结合蛋白。【方法】原核表达及纯化TAA功能区BD3蛋白,与猪肺组织共孵育,通过免疫共沉淀技术捕获BD3的结合蛋白并质谱鉴定。构建猪c DNA文库获取该蛋白核酸序列,进行生物信息学分析。【结果】经质谱分析获得与BD3结合的猪肺组织蛋白的肽段,数据库搜寻比对发现角蛋白1为TAA BD3区与猪肺组织结合的蛋白;构建c DNA文库筛选并测序后获知其基因序列。生物信息学分析显示该序列与猪源及人源角蛋白核酸序列相似性低,猪源细胞角蛋白1作为一个单独的进化分支,与其他角蛋白差异较大;该蛋白在8-100 aa处有一个跨膜区;主要二级结构元件为α螺旋和β折叠;该蛋白在82-362 aa处存在一个G蛋白α亚单位,在515-552 aa处存在一个TSP1区域(凝血酶敏感蛋白1型重复区域)。【结论】与TAA茎部BD3结合的猪肺组织角蛋白1的发现,为TAA黏附肺组织细胞的研究奠定基础,有助于揭示APP专嗜肺组织的致病机制。

胸膜肺炎放线杆菌血清8型自转运黏附素基因的克隆测序及功能预测分析

为研究胸膜肺炎放线杆菌(APP)三聚体自转运黏附素(TAAs)的功能,以GenBank登录的APP血清5b型自转运黏附素基因5'端的3875bp序列设计引物,通过PCR的方法首次获得APP血清8型运黏附素N端的基因序列片段,测序结果与已知血清型的基因序列和氨基酸推导序列分别进行比对,结果表明与血清7型自转运黏附素N端同源性达到93%,氨基酸推导序列同源性达到97%;与血清5b型自转运黏附素N端同源性达到92%,氨基酸推导序列同源达到100%。经软件分析获得的序列含有与细菌的黏附、聚集和侵入密切相关的Hep_Hag基序,应用马克斯-普朗克研究所的在线分析TAAs的基序和蛋白域的软件daTAA,进行预测并证明所得序列为TAAs,并且具有完整的N段头部序列,有重要功能区具有良好的抗原性。比对的结果为寻找研究APP的定植基序和毒力因素提供了重要基础。

胸膜肺炎放线杆菌血清8型自转运黏附素基因克隆测序及功能区对比

为研究胸膜肺炎放线杆菌(APP)三聚体自转运黏附素(TAAs)的功能,通过PCR的方法首次获得APP血清8型的基因序列并提交GenBank(bankit1392817 HQ399552),运用生物信息学的方法对APP血清8型基因序列进行分析,并与GenBank公布的已知血清型的基因序列进行比对。结果表明:与血清7型同源性达到93%;与血清3,5b型同源性均达到92%。对APP血清8型序列软件预测分析发现,含有大量的Ylhead和Hep_Hag基序,所得序列是三聚体自转运黏附素N段序列,具有良好的抗原性。