介绍一种细胞凋亡TUNEL检测与Ki-67 DAPI三色荧光染色操作流程

肿瘤生物治疗基础研究中,对不同小分子靶向治疗药物进行疗效评估时,除可以测量肿瘤大小外,还需利用TUNEL技术检测肿瘤细胞凋亡程度及行免疫荧光染色检测Ki-67蛋白肿瘤细胞增殖程度。凋亡细胞增多,增殖的肿瘤细胞减少,可以初步推测肿瘤治疗有一定疗效。本文首次采用细胞凋亡TUNEL技术检测Ki-67 DAPI三色荧光染色在同一张肿瘤石蜡切片上同时检测凋亡的肿瘤细胞及增殖的肿瘤细胞,结果较稳定,现介绍如下。

三色荧光标记鉴定早孕蜕膜及外周免疫细胞组成

目的建立早孕妇女蜕膜免疫细胞高纯度的分离方法,流式细胞术多色荧光直接标记分析早孕蜕膜及外周血主要免疫细胞的构成比。方法经胶原酶消化、Percoll密度梯度离心、短期培养结合的方法分离纯化蜕膜免疫细胞,采用三色、双色及单色荧光直接标记流式细胞术分别检测早孕妇女和对照组中蜕膜、外周血CD3-CD56+CD16-和CD3-CD56+CD16+NK细胞、NKT和γδT细胞、T细胞和单核细胞的阳性率。结果与外周血相比,蜕膜免疫细胞以CD3-CD56+CD16-数量最多,约占免疫细胞总数的(67.02±18.33)%,T细胞占(11.05±7.22)%,单核细胞占(5.28±0.29)%,NKT细胞占(2.35±1.62)%;早孕妇女外周血T淋巴细胞较正常生育期妇女明显下降(P<0.05),而早孕妇女外周血中NK细胞、NKT细胞、单核细胞数量与对照组相比无显著差别。结论早孕妇女蜕膜中具有与外周血不同的免疫细胞组成,应用多色荧光标记的流式细胞术能够简单、直接地鉴定各免疫细胞亚群。

三色荧光标记抗体在急性白血病免疫分型中的应用

目的 :探讨多参数分析流式细胞术白血病免疫分型的方法。方法 :用自行设计的七组三色荧光标记抗体组合 ,共含 15种抗体 ,对 2 0 0例急性白血病患者骨髓或外周血进行流式细胞术免疫分型。结果 :应用本组抗体组合可对T 急性淋巴细胞白血病、B 急性淋巴细胞白血病和急性粒细胞白血病 M1 M7患者作出免疫学诊断 ,并可诊断形态学难以辨认的及一般免疫分型法较难诊断的单核细胞白血病。结论 :三色荧光标记抗体组合可用较少的抗体 ,特异地对急性白血病各亚型进行多参数免疫表型分析 。

流式细胞仪三色荧光标记技术在白血病免疫分型中的应用

目的探讨流式细胞仪三色荧光标记技术在白血病免疫分型中应用价值。方法选择该院2011年1月‐2014年1月收治的120例急性白血病患者作为研究对象,抽取患者外周血进行流式细胞术免疫分析,采取自行设计的7组三色荧光标记抗体组合,共含15种抗体。结果 60例标本经单色荧光标记技术检测,T细胞免疫表型急性淋巴细胞白血病(T-ALL)27例,急性B细胞型淋巴细胞性白血病(B-ALL)11例,急性非淋巴细胞白血病(ANLL)22例;细胞分群问题致诊断不明确11例(18.3%);初始诊断与最终诊断不符3例(5.0%),其中,2例为单纯髓系白血病,1例为单纯淋系白血病。经三色荧光标记技术检测后,90%的白血病患者类型及免疫分型可明确诊断。结论流式细胞仪三色荧光标记技术在白血病免疫分型诊断中具有重要价值,诊断正确率较高。

用三色荧光原位杂交(Three-Color FISH)检测小鼠精子中染色体数目异常的研究

用小鼠X、Y和8号染色体特异的DNA探针，与经DTT（dithiotreitol）和LIS（lithium-3，5-diiodosalicylicacid）解聚的小鼠附单精子进行三色荧光原位杂交（fluoresceoceinsituhybridization，FISH），以检测精子中的染色体数目异常，并与MMⅡ染色体分析比较．结果表明精子三色FISH具有以下优点和特点：（1）方法敏感稳定，且简便快速；（2）在每一个体至少分析10000尾精子的基础上计算非整倍体单，因此结果更为准确；（3）能检测多倍体即减数分裂停止的发生率及停止的时期；（4）不仅能测定发生于试数分裂Ⅰ（MI）的染色体分离异常，还能检测发生于减数分裂Ⅱ（MII）的不分离和丢失．并对探针的选用、分析标准的建立以及三色FISH用于精于染色体分析的必要性等进行了讨论．

三色荧光抗体染色法测定T细胞亚群方法学的建立及临床应用

目的:研究三色荧光抗体染色方法测定人外周血T淋巴细胞亚群并探讨其临床应用。方法:三色荧光抗体染色流式细胞术测定15例健康志愿者及15例尖锐湿疣(CA)患者外周血Th1/Th2亚群及Tc1/Tc2亚群比例。结果:标本经流式细胞仪检测结果稳定。与健康对照组比较,CA患者Th1及Tc1细胞含量、Tc1/Tc2比值均减少(P<0.05),该结果与文献报道的采用其他方法检测结果相一致。结论:三色荧光抗体染色流式细胞术能敏感精确地测定机体外周血T淋巴细胞亚群变化情况。

弱精子症患者精子X，Y，18号染色体的三色荧光原位杂交分析

目的:利用三色荧光原位杂交方法分析弱精子症患者精子X,Y,18号染色体数目畸变。方法:应用X、Y、18号染色体探针对10例弱精子症患者和5例健康男性进行三色荧光原位杂交实验,检测其精子非整倍体数目畸变情况。结果:计数45547个精子,杂交率99.18%。双体类型为XX18、XY18、YY18、X1818、Y1818。病例组各类双体率分别为(0.124±0.086)%、(0.360±0.380)%、(0.109±0.195)%、(0.342±0.746)%、(0.299±0.564)%。对照组各类双体率为(0.014±0.019)%、(0.090±0.080)%、(0.030±0.031)%、(0.068±0.103)%、(0.075±0.083)%。病例组的非整倍体率9.25%,对照组为2.70%,两者比较,差异有显著性(P(0.01)。结论:弱精子症患者的精子比对照组精子的染色体非整倍体率高,为提供更有效的科学依据,尚需大样本研究。

三色荧光技术在SNP检测中的应用

利用三色荧光标记的A、C、T双脱氧核苷酸单碱基延伸的方法结合编码寡核苷酸芯片技术检测单核苷酸多态性 (SNP)的基因型。以beta地中海贫血样本基因 (HBB基因 )突变作为模型的研究结果显示该方法能同时对多位点的SNP进行检测。

应用三色荧光抗体染色技术检测尖锐湿疣患者T细胞亚群

我们应用三色荧光抗体染色技术,经流式细胞仪对30例CA患者外周血T淋巴细胞及其亚群进行检测,现将结果报道如下.

基于氧化石墨烯及染料标记的核酸三色荧光探针检测汞离子

利用氧化石墨烯(GO)、两种荧光染料标记的单链DNA及核酸染料SYBR GreenⅠ(SG-Ⅰ),构建了能特异性识别Hg^(2+)的三色荧光探针,建立了一种快速、高效、高灵敏定量检测水体中汞离子(Hg^(2+))的新方法。在这种探针中,两种染料Tetramethyl-6-carboxyrhodamine(TAMRA)和Cyanine-5(Cy-5)分别标记在两条单链DNA的5’端,这两条单链DNA中有一部分碱基互补配对,未互补的碱基均为胸腺嘧啶(T碱基)。在没有Hg^(2+)存在时,两种荧光染料标记的单链DNA被吸附在GO的表面,TAMRA和Cy-5与GO靠近,荧光被GO猝灭,它们的荧光信号都很弱;此时,SG-Ⅰ被吸附在GO的表面或游离在溶液中,荧光信号也很弱。在有Hg^(2+)存在时,两种荧光染料标记的单链DNA通过T-Hg^(2+)-T结构特异性结合形成双链DNA,从而脱离GO的表面,TAMRA和Cy-5远离GO,荧光信号恢复;与此同时,SG-Ⅰ与双链DNA结合,荧光强度显著增强。根据TAMRA、Cy-5及SG-Ⅰ荧光强度增加的程度即可对Hg^(2+)进行定量分析。在优化条件下,当Hg^(2+)的浓度在1.0×10^(-9)~5.0×10^(-8)mol/L范围内时,TAMRA、Cy-5及SG-Ⅰ荧光强度之和与汞离子的浓度具有良好的线性关系,方法的检出限(LOD)为1.1×10^(-10)mol/L,实际水样的加标回收率在96.00%~105.00%之间。该方法用于实际水样中Hg^(2+)检测,获得了较为满意的结果。

三色和双色荧光标记流式细胞术对肾移植免疫反应新指标TLR4的监测

目的比较三色和双色荧光标记流式细胞术(FCM)在肾移植术后免疫指标TLR4监测中的优缺点。方法选取10例肾移植术后病例,分别采用三色和双色FCM检测外周血单核细胞中CD14、TLR4和CD80表达情况,计算CD14阳性单核细胞中TLR4和CD80的表达百分率并进行统计比较。结果两种方法检测CD14阳性单核细胞中TLR4和CD80阳性表达百分率均无显著性差异(P=0.198,P=0.872),两种方法对相同血标本的检测结果均呈正相关关系(积矩相关系数r=1,P=0.000;积矩相关系数r=0.999,P=0.000)。另外,应用三色FCM还可同时获得单核细胞中TLR4和CD80双阳性的表达情况。结论三色和双色FCM检测TLR4的结果无显著性差异,但三色FCM可同时显示TLR4与其下游分子CD80双阳性表达情况,对揭示TLR4参与移植免疫反应机制具有重要价值,而且血标本用量少,节约单克隆抗体。

用三色荧光原位杂交检测人精子染色体非整倍体率

目的建立人精子间期核三色荧光原位杂交(tripl-color fluorescence in situhybr idizat ion)的实验方法。方法采用三色荧光原位杂交技术对10例和正常精子标本进行间期核的原位杂交,并统计精子间期核13、16、18、21、22、X、Y染色体的杂交信号数量。结果在显微镜下可见精子头部有杂交探针的信号,间期核背景经DAPI复染显示蓝色。结论本法具有荧光杂交信号直观易分辨、短时间内能大量分析精子数量和实验操作相对简便、结果准确可信等优点。

Beckman Coulter三色荧光抗体干粉试剂检测CD4+T淋巴细胞的应用评价

目的通过对三色荧光抗体干粉试剂(CD3/4/8)(Beckman Coulter,简称BC干粉试剂)应用于两种流式细胞仪(BD FACSCalbur和Beckman Coulter FC500)获得CD4+T淋巴细胞(简称CD4)检测结果的比较,从而评估其现场应用价值。方法 2015-11/12期间在四川省收集的198份HIV阳性静脉全血,以BD FACSCalibur流式细胞仪配套BD三色荧光抗体试剂(CD3/4/8)(简称BD试剂)作为参考方法,对BC干粉试剂在两种仪器上获得CD4结果的准确性和重复性进行评价。结果 BC干粉试剂在FACSCalbur、FC500流式细胞仪上获得CD4计数与参考方法结果的Pearson相关系数分别为0.84、0.95;平均偏差分别为-7个/μl(LOA:320.7~297.0个/μl)、5个/μl(LOA:180.3^-171.0个/μl);将CD4计数结果按≥500、350~500、200~350、<200个/μl进行分层,BC干粉试剂在两种仪器上的检测结果与参考方法比较无统计学差异(χ~2=0.431,P>0.05)、(χ~2=0.527,P>0.05);BC干粉试剂在两种仪器上获得CD4结果与参考方法无统计学差异(t=1.044,P>0.05)、(t=0.769,P>0.05);BC干粉试剂在两种流式细胞仪上检测的结果的平均偏差为-7个/μl(LOA:313.0^-326.6个/μl)。1~53号样本用BC干粉试剂分别在FACSCalbur和FC500流式细胞仪上重复检测1次,相同机型复检结果与第一次检测结果比较无统计学差异(t=0.26,P>0.05)、(t=0.235,P>0.05)。结论 BC干粉试剂应用于FACSCalbur和FC500流式细胞仪获得CD4结果具有较好的相关性和一致性,检测重复性较好。

鼠疫耶尔森氏菌三色荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种三色荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。方法根据鼠疫耶尔森氏菌pPCP1质粒上的pla基因、编码F1抗原在pMT1质粒上的ca f1基因以及菌体染色体上的3a基因序列,设计特异性的引物和不同荧光标记的Taqman荧光探针,优化反应体系和扩增条件,考察该方法检测的敏感度、特异性、重复性和稳定性,最终建立三色荧光定量PCR检测方法。结果本研究所建立的方法对鼠疫耶尔森氏菌DNA的扩增效率高,最低检出限为1×102copies/ml,特异性高,重复性的变异系数在合理范围内,稳定性好。结论建立了一种同时检测鼠疫耶尔森氏菌pla、ca f1和3a基因的三色荧光定量PCR方法,该方法敏感度和特异性高,能够实现快速检测的目的。

三色免疫荧光标记法检测外周血Th细胞亚群

目的建立一种流式细胞仪三色法检测外周血Th细胞亚群的方法。方法外周全血用RPMI1640培养液和终浓度为25ng/ml的PMA、1μg/ml的Ionomycin、20ng/ml的Monensin培养2h,固定和破膜后,加入荧光标记的CD4、IFN-γ和IL-4抗体,应用流式细胞仪进行检测。结果CD4+细胞与CD4-细胞能明显区分,12份标本Th0、Th1和Th2分别为(2.46±0.97)%、(12.77±4.01)%和(1.82±0.81)%。结论三色免疫荧光标记法可以同时快速准确地测定外周血Th0、Th1和Th2细胞亚群。

我国研制出具有世界先进水平的电视用荧光粉

我国新近研制出的彩色投影电视用荧光粉亮度大,对比度高,主要技术指标达到了世界商用投影管的要求,达到了世界先进水平。这种高科技含量的荧光粉是由中国科学院长春光学精密机械与物理研究所研制成功的。

三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统的建立及评价

目的建立三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统，并评价其在检测HPV九价疫苗免疫血清免疫原性的应用。方法分别选取红色、绿色和蓝色荧光蛋白的质粒N31-MCHREEY、N31-EGFP和N31-mTagBFP构建HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒，利用双抗夹心法和病毒半数组织培养感染剂量法检测HPV假病毒浓度和感染滴度；利用单色荧光与三色混合荧光HPV16/33/45假病毒，检测HPV九价疫苗免疫小鼠血清的中和滴度，以验证三色混合荧光HPV假病毒系统的准确性；采用单色荧光和三色混合荧光HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒系统检测HPV九价疫苗免疫食蟹猴血清的中和滴度，判断其是否可应用于HPV九价疫苗免疫血清的免疫原性检测。结果含有绿色、红色和蓝色荧光质粒的HPV16型假病毒的浓度为5~6 μg/ml，HPV6/11/18/31/33/45/52/58的三色混合荧光假病毒浓度为1~3 μg/ml。获得了分别含有EGFP、Mcherry和mTagBFP报告基因的9个型别的HPV假病毒，且满足中和检测需要；9个型别单色荧光HPV假病毒的滴度值均在1×104~1×105之间，即它们具有相似的感染滴度。检测HPV九价疫苗免疫的小鼠血清时，单色荧光与三色混合荧光HPV16/33/45假病毒系统所得中和滴度值差异均无统计学意义（P值均〉0.05）；检测HPV九价疫苗免疫的食蟹猴血清时，单色荧光与三色混合荧光A、B和C组HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒所得中和滴度值差异均无统计学意义（P值均〉0.05）。结论成功地建立了三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统；验证其与单色荧光HPV假病毒系统具有一致性；证实其可应用于检测HPV九价疫苗免疫血清的免疫原性检测中。

系统性红斑狼疮患者淋巴细胞亚群早期凋亡的初步研究

目的:检测系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中不同细胞亚群发生凋亡的情况,并初步分析其在SLE发病机制中的意义。方法:取28例SLE患者和性别年龄与之相匹配的20个正常对照者。采用淋巴细胞亚群标志、An-nexin-V及碘化丙啶三色荧光标记、流式细胞术检测细胞的早期凋亡。结果:SLE患者体内CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的凋亡百分率均显著高于正常对照组(P<0.05)。同时,SLE患者T淋巴细胞的死亡百分率也高于正常人。经激素治疗一定时间后,这些细胞亚群的凋亡率会进一步升高(P<0.01),但CD4/CD8比值恢复至接近正常人。SLE患者体内CD19+B淋巴细胞的凋亡或死亡百分率和正常对照组相比均无明显差别,激素治疗对B细胞凋亡和死亡的影响亦不显著。结论:在SLE患者体内主要是T淋巴细胞凋亡增加,但SLE患者淋巴细胞数目减少不仅仅是因为细胞凋亡所致,死亡细胞数目明显升高也是其中一个重要原因。激素治疗可诱导SLE患者T淋巴细胞进一步发生凋亡,并使T细胞亚群比例有所改善。

硬腭裸露骨面面积对上颌骨及牙弓生长发育的影响

目的了解不同硬腭裸露骨面面积与上颌骨及牙弓生长发育之间的关系及相关机制,为设计与选择合理的腭裂修复术式提供实验依据。方法选取3周龄SD雄性大鼠48只,随机分为对照组和3个实验组,每组12只。3组实验组大鼠分别被切去硬腭1/4、2/4和3/4面积大小的粘骨膜瓣,大鼠术后每周同期交替注射荧光标记物(对照组同期注射),每2周随机处死每组标记动物3只,解剖出上颌骨,制备成硬组织切片,测量上颌骨和牙弓宽度,观察荧光标记的差异。结果实验表明:①当裸露面积小于硬腭面积1/4时,上颌骨新骨形成和组织学变化不大,并且可获得接近正常的上颌骨和牙弓发育。②随着硬腭裸露面积的增加,上颌骨及牙弓生长发育受限越严重,牙齿内倾更加明显,组间存在着统计学差异。③裸露面积越大,对硬腭新骨形成和腭中缝的结构影响越大,表现为荧光标记线越不规则,标记间距变窄,当裸露面积达硬腭面积的3/4时,甚至产生弥散的荧光标记(即骨坏死)和腭中缝结构的丧失。结论硬腭裸露面积与上颌骨及牙弓发育之间的关系密切,裸露面积越大,上颌骨及牙弓发育受限越严重。

冠心病患者血小板CD62p及GpⅡb/Ⅲa的变化

目的 观察冠心病患者血小板膜P选择素(CD62p)和GpⅡb/Ⅲa(PAC 1)的变化及其临床意义。方法 采用流式细胞术(FCM)三色荧光标记技术检测40例冠心病患者及30名正常人血小板膜CD62p和PAC 1的阳性百分率。结果 冠心病组血小板CD62p[ (27. 6±14. 0)% ]与PAC 1[ (31. 8±16. 7)% ]阳性百分率显著高于对照组[ (3. 1±1. 5)%, (7. 0±1. 8)%,P均<0. 01]。结论 CD62p和PAC 1是血小板活化的敏感和特异指标,全血流式细胞术测血小板功能可用于冠心病的监测和评价抗血小板药物的疗效,监测治疗干预的效果和预测并发症。