三角酵母D-氨基酸氧化酶的固定化研究

通过共价结合的方法把三角酵母 D-氨基酸氧化酶 (DAO)分别固定在三种大孔高聚物和二种多糖的载体上 ,结果表明多糖类载体壳聚糖和 Sepharose4B比高聚物更能有效地固定化 DAO。经过固定化后 ,壳聚糖和环氧载体Epecust固定化酶对温度和 p H的稳定性提高 ,表观米氏常数增大。在分批式头孢菌素 C氧化脱氨的反应中 ,固定化酶表现出良好的操作稳定性 ,戊二酸单酰基 - 7-氨基头孢霉烷酸的得率为 93%。

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

从三角酵母中提取总RNA ,反转录后进行PCR扩增得到D 氨基酸氧化酶 (D AminoAcidOxidase ,DAAO)基因 ,经测序可知 ,与文献中三角酵母的DAAO基因序列的同源性在 99%以上。将DAAO基因用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后 ,与相同酶切的大肠杆菌表达载体pET 2 8a连接 ,转化大肠杆菌TOP 1 0F′,并筛选得到重组质粒pET DAAO ,转化BL2 1 (DE3)感受态细胞 ,得到重组大肠杆菌BL2 1 (DE3) pET DAAO。对重组大肠杆菌中的D 氨基酸氧化酶进行了诱导表达 ,考察了诱导温度、菌浓度、诱导剂IPTG用量以及溶氧等因素对酶活的影响。结果表明 ,在 2 8℃、菌浓度 (OD6 0 0 ) 1 0、IPTG浓度 1mmol L时 ,DAAO酶活最高达 2 3 3U mL。研究进一步显示 ,用廉价无毒的乳糖可以替代IPTG进行诱导 ,当乳糖浓度为 2mmol L ,DAAO酶活可达 2 2 7U mL。经过补料分批培养和乳糖诱导 ,DAAO酶活可以达到 1 75U mL。

提高三角酵母细胞DAO表观活力的透性化研究

三角酵母 (Trigonopsisvariabilis)的D 氨基酸氧化酶 (D aminoacidoxidase ,DAO ,EC1 .4.3.3)是一种胞内酶 ,完整细胞并不呈现酶促活性。为了获得三角酵母细胞的较高表观活力 ,需对细胞进行处理以改变壁和膜对反应底物和产物的通透性。研究中比较了冻融、丙酮、丁醇和十六烷基三甲基溴化铵 (Cetyltrimethylammoniumbro mide ,CTAB)等理化因子的透性化效率 ,并对丙酮的透性化条件进行了优化。证明丙酮的透性化作用与溶剂浓度、保温时间和温度有关。 30 %～ 35 %丙酮浓度 ,4～ 2 8℃保温 ,可得到最大酶活力。透性化所需时间极短 ,在 5min内即可完成。同时 ,透性化细胞中的DAO比无细胞抽提液中的酶对热更为稳定。用丙酮透性化细胞作为生物催化剂可有效地转化头孢菌素C(CephalosporinC ,CPC)为戊二酰 7ACA(Glutaryl 7 ACA ,GL 7ACA)。

三角酵母二倍体菌株的选育

由三角酵母(Trigonopsis variabilis)原生质体融合,获得了35株原养型融合子。通过对其中四株进行详细分析表明,融合子细胞体积和 DNA 含量为两亲株之和,苏木精染色显示单核,这些结果证明融合子为亲株的二倍体。此外,融合子的生长速度、D-氨基酸氧化酶以及细胞蛋白质含量均明显高于亲株。电镜形态观察进一步证明融合子细胞大于亲株。

三角酵母整细胞酶促转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烷酸

研究了利用含D 氨基酸氧化酶 (D aminoacidoxidase ,DAOEC1.4.3 .3)的透性化三角酵母多倍体FA10(TrigonopsisvariabilisFA10 )细胞酶促转化头孢菌素C(cephalosporinC ,CPC)为戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (Glutaryl 7 ACA ,GL 7ACA)的反应过程和细胞中同时存在的过氧化氢酶 (Catalase ,CAT)通过水解H2 O2 而对转化反应产生的干扰作用及其对策。实验证明适量添加外源H2 O2 (6 % )或在反应体系中加入过氧化氢酶抑制剂NaN3(0 .13mg/mL)可使GL 7ACA生成率分别为 73 0 %和 70 1%。如果将透性化的FA10细胞在 pH10 .5～ 11 0 ,2 0℃条件下保温 30min ,CAT被不可逆性完全钝化 ,以无过氧化氢酶的FA10细胞进行CPC的酶促转化反应 ,GL 7ACA的生成率可达 84%。

三角酵母原生质体的形成、再生和融合

三角酵母由于其胞内酶D-氨基酸氧化酶活力较高,具有一定的应用价值。关于这种酶的开发和利用国内外均有报道。本文报告利用原生质体融合法来进行三角酵母菌种选育,以期获得D-氨基酸氧化酶活力较高的菌株。

变异三角酵母D—氨基酸氧化酶基因的克隆与表达

参照GenBank中D—氨基酸氧化酶基因序列设计引物,利用跨内含子PCR技术从变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)基因组中扩增D—氨基酸氧化酶基因编码区序列。将DAAO基因用NcoⅠ和HindⅢ双酶切后,与经相同酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达变异三角酵母D—氨基酸氧化酶的工程菌株BL21(DE3)/pET-28a-DAAO。测序结果表明所克隆的基因序列与GenBank中变异三角酵母D—氨基酸氧化酶基因序列同源性达99%以上。SDS-PAGE分析及酶活测定表明所构建的工程菌能高效表达D—氨基酸氧化酶,且表达产物有较高酶活力。

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因的克隆、测序及表达

利用跨越内含子的ＰＣＲ技术，从三角酵母（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）变种ＦＡ１１０中扩增得到Ｄ氨基酸氧化酶基因（ｄａａｏ），并通过ＴＡ克隆的方法将其克隆至ｐＧＥＭＴ载体。序列测定结果表明，所得ｄａａｏ基因的５′端内含子已被删除，基因总长度为１０７１ｂｐ，它与Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓ的Ｄ氨基酸氧化酶同源性达９８３％，与Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ和Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｃｉｌｉｓ的同源性分别是３８９％和３０８％。为提高表达水平，又将此基因转移至高表达载体ｐＥＴ２８ｂ上，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行诱导表达。经ＩＰＴＧ诱导，目的蛋白的产生量可占菌体总蛋白量的４６％，分子量约为３８ｋＤ。Ｄ氨基酸氧化酶的活力可达８０２ｕ／Ｌ。

重组具有改良特性的D-氨基酸氧化酶

在大肠杆菌细胞中表达三角酵母D-氨基酸氧化酶,并对重组酶的性质进行了研究。制备的单一突变体与野生型酶相比,具有2.4倍的热稳定性或底物特异性变化光谱。结果显示突变的TvDAAO在氧化头孢菌素中催化效果优于野生型酶。并将一个突变的重组TvDAAO制备成结晶,并解析了2.8?分辨率下的晶体结构。