Tau/APP/PS1三转基因小鼠模型的建立及生物学特征

目的：建立Tau／APP／PS1三转基因小鼠模型，从分子生物学、行为学及病理学角度研究其生物学特征。方法：将自行建立的Tau转基因小鼠与Jackson实验室引种的APP／PS1双转基因小鼠杂交、传代；PCR鉴定小鼠基因型；RT-PCR检测外源基因的转录；Western blot测定外源基因的蛋白表达；Bielachowsky氏染色法和ABC免疫组化法观察大脑神经纤维缠结和老年斑等病理改变；Morris水迷宫观测学习记忆的改变。结果：Tau／APP／PS1三转基因小鼠的大脑可转录和表达Tau、APP和PS1三种外源基因，6～8月龄时大脑皮层和海马可见神经元纤维缠结和老年斑，其学习记忆获得能力在6月龄开始受损。结论：建立的Tau／APP／PS1三转基因小鼠具有Tau和Aβ两种病理改变和学习记忆障碍，为深入探究Tau与邸的关系、阐明AD的发病机制以及研发靶点治疗药物提供实验工具。

Tet-on和Cre/loxP系统双重调控表达丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶三转基因小鼠的建立

目的:建立Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控表达丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠。方法:选择适龄并经鉴定的在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达Cre重组酶的双转基因小鼠Lap/LC-1与在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达萤光素酶(Luc)的双转基因小鼠Lap/NS3/4A交配,子代小鼠经PCR检测、筛选基因组中NS3/4A、Lap、LC-1等3个转基因片段均阳性的小鼠。三阳性的NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经多西环素(Dox)诱导1周后,以在体生物发光成像系统(BLI)检测报告基因Luc的表达,免疫组化检测小鼠体内Cre重组酶、HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的表达状况。结果:NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经Dox诱导后,BLI结果显示仅在小鼠肝脏部位有强烈的发光信号,表明这些小鼠肝细胞内报告基因Luc特异高效表达;免疫组化结果证实Cre重组酶、NS3/4A蛋白酶仅在经诱导后的小鼠肝细胞中特异性表达。结论:建立了Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控下表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的三转基因小鼠模型,为进一步研究HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在HCV感染后与宿主相互作用的机制,以及抗NS3/4A丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂的筛选奠定了基础。

雄性APP/PS1/Tau三转基因小鼠阿尔茨海默病样病理的年龄相关性变化

目的用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)方法观察2~15月龄雄性APP/PS1/Tau三转基因小鼠(Triple transgenic mice,3xTg),每两月龄,海马及感觉皮质中阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)相关病理的年龄相关性变化。方法雄性3xTg-AD三转基因小鼠按2、4、6、8、10、12、15月龄分为7组,每组各3只,作为实验组;雄性C5B7L/6J小鼠(Wild Type,WT)按2、4、6、8、10、12、15月龄分为7组,每组各3只,作为对照组。用免疫组化法方法检测各个小鼠脑组织海马及感觉皮质与阿尔茨海默病密切相关的病理年龄相关性变化:Aβ、磷酸化tau、人tau P301L突变体的转基因产物、星形胶质细胞增生、神经元标记物。结果与C5B7L/6J小鼠相比,APP/PS1/Tau三转基因小鼠Aβ细胞(6E10)、p-tau(AT8,Ser202/Thr205)、tau(HT7)星形胶质细胞(GFAP)免疫染色强度显著增强,P<0.0001;2~15月龄雄性APP/PS1/Tau三转基因小鼠海马及感觉皮质均未出现明显淀粉样斑块沉积,海马CA1区Aβ细胞(6E10)8月龄开始染色程度逐渐增强,感觉皮质区染色程度保持不变,P<0.05;CA1区tau(HT7)2~6月龄染色程度较弱,6~15月龄染色程度保持稳定,感觉皮质区2~4月龄染色程度升高,4~15月龄染色程度保持稳定,P<0.05;CA1区p-tau(AT8,Ser202/Thr205)6月龄磷酸化程度开始升高,感觉皮质区12月龄磷酸化程度开始升高,P<0.05;CA1区及感觉皮质区星形胶质细胞(GFAP)2~15月龄反应性逐渐增强;CA1区成熟神经元标记物(NEUN)数量2~6月龄逐渐减少,6~15月龄稳定,CA3区NEUN数量2~15月龄逐渐降低,P<0.05。结论3xTg-AD小鼠在年龄和表型的发展之间显示出明显的相互作用,这使其成为研究衰老在疾病发病机制中作用的重要工具。

小檗碱对三转基因阿尔茨海默病小鼠海马组织Aβ和Bcl-2、Bax表达的影响

目的:观察旋小檗碱对APP/PS1/Tau三转基因阿尔茨海默病(AD)小鼠海马组织β-淀粉样蛋白(Aβ)和Bcl-2、Bax表达的影响。方法:20只三转基因AD小鼠随机分为对照组和给药组,各10只。加药组给予小檗碱50 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,对照组给予等容量生理盐水灌胃,共3个月。Western Blot检测小鼠海马组织蛋白Aβ、Bcl-2和Bax表达,免疫组化测定小鼠海马Aβ表达,ELISA检测小鼠海马Bcl-2、Bax表达。结果:给药组海马组织Aβ表达较对照组降低(P<0.05);与对照组比较,给药组海马组织Bcl-2表达增加而Bax表达减少(P<0.05)。结论:小檗碱能降低三转基因AD小鼠的Aβ表达,其机制可能与Bcl-2和Bax表达改变有关。

小檗碱体外对三转基因阿尔茨海默症小鼠海马神经元内质网应激及凋亡的影响

目的探讨小檗碱体外对三转基因阿尔茨海默症(AD)小鼠海马神经元内质网应激及凋亡的影响。方法取出生24 h内三转基因AD乳鼠,分离培养海马神经元。将海马神经元分为对照组、1μmol/L小檗碱组和10μmol/L小檗碱组,培养第7天,后两组分别用1、10μmol/L小檗碱干预,而对照组给予等体积药物溶剂二甲基亚砜。采用TUNEL染色法检测各组神经元细胞凋亡率,采用MTT法检测各组神经元细胞存活率,采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试剂盒检测各组神经元培养上清液LDH释放率,采用Western blotting法检测各组内质网应激相关蛋白[葡萄糖相关蛋白78(GRP78)]以及凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bcl-2、Bax)表达。结果与对照组比较,1μmol/L小檗碱组、10μmol/L小檗碱组神经元细胞凋亡率、LDH释放率、Caspase-3及Bax蛋白表达均下降,细胞存活率、GRP78及Bcl-2蛋白表达均增加(P均<0. 05);且10μmol/L小檗碱组较1μmol/L小檗碱组上述指标变化更明显(P均<0. 05)。结论小檗碱体外可抑制AD小鼠海马神经元内质网应激,减少神经元凋亡,其机制可能与上调GRP78蛋白、抗凋亡蛋白Bcl-2表达及抑制Caspase-3蛋白、促凋亡蛋白Bax表达有关。

阿尔茨海默病样三重转基因小鼠血小板的功能改变及机制探讨

目的探讨常见的阿尔茨海默病(AD)小鼠模型APP/PS-1/tau(3xTg)小鼠血小板功能变化情况及机制分析。方法实验小鼠分为3xTg-AD组和WT组;采用流式细胞术和粘附试验等方法评价3xTg-AD和WT小鼠血小板的功能;并采用Western blotting方法对其机制进行探讨。结果老年3xTg-AD小鼠血小板计数和糖蛋白表达与对照WT小鼠差异无统计学意义(P>0.05)。但是与对照WT小鼠相比,3xTg-AD小鼠血小板与纤维蛋白原的粘附能力增强(P<0.05)。此外,与纤维蛋白原粘附功能增强的3xTg-AD小鼠血小板信号蛋白的磷酸化也增加,包括PI3激酶Akt和p38MAP激酶(P<0.05)。然而,两组小鼠中由激动剂诱导的活化血小板无统计学差异(P>0.05)。结论 3xTg-AD小鼠循环血液中血小板粘附功能增加,可能与AD疾病的进展相关。

二苯乙烯苷对APP/PS1/Tau三转基因痴呆小鼠JNK和PP2B的调控作用研究

目的:研究二苯乙烯苷(TSG)对APP/PS1/Tau三转基因痴呆(3×Tg-AD)小鼠c-Jun氨基末端激酶(JNK)、钙调神经磷酸酶(PP2B)的调控作用,探索该药抗阿尔茨海默病(AD)的可能机制。方法:将45只雄性3×Tg-AD小鼠随机分为模型组、阳性对照组(石杉碱甲,0.15 mg/kg)和TSG低、中、高剂量组(0.033、0.1、0.3 g/kg),每组9只;另取9只正常雄性C57BL/6J小鼠作为正常对照组。各给药组小鼠灌胃相应药物,每天给药1次,连续给药60 d;正常对照组和模型组小鼠灌胃等量生理盐水。给药结束后,通过Morris水迷宫实验测定各组小鼠的空间学习记忆能力,采用尼氏染色法观察小鼠大脑皮层和海马部位尼氏小体变化情况,并分别采用实时荧光定量-聚合酶链式反应法和Western blotting法检测小鼠脑组织中JNK、PP2B的mRNA及蛋白表达情况。结果:与正常对照组比较,模型组小鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.01),原平台象限停留时间显著缩短(P<0.01),穿越平台次数显著减少(P<0.01);脑皮层和海马部位尼氏小体数量显著减少、着色浅;脑组织中JNK mRNA及其蛋白的相对表达量显著升高(P<0.01),PP2B mRNA及其蛋白的相对表达量显著降低(P<0.01)。与模型组比较,阳性对照组和TSG各剂量组小鼠逃避潜伏期显著缩短(P<0.01),原平台象限停留时间显著延长(P<0.01);穿越平台次数显著增加(P<0.01);脑皮质和海马部位尼氏小体数量显著增加、着色深;脑组织中JNK蛋白的相对表达量显著降低(P<0.05或P<0.01),PP2B mRNA及其蛋白的相对表达量显著升高(P<0.01),且TSG高剂量组小鼠脑组织中JNK mRNA的相对表达量显著降低(P<0.05)。结论:TSG对3×Tg-AD小鼠的学习记忆能力及神经元损伤有一定改善作用,其机制可能与下调蛋白激酶JNK的转录和表达、上调蛋白磷酸酶PP2B的转录和表达有关。

APP/Tau/PS1三转基因阿尔茨海默病小鼠行为学、炎症反应及自噬水平的研究

目的 观察各月龄淀粉样前体蛋白/Tau蛋白/早老蛋白-1（APP/Tau/PS1）三转基因小鼠的行为学特征,并研究随着阿尔茨海默病（AD）小鼠病程进展脑内炎症水平及自噬水平的变化。 方法 通过Morris水迷宫实验对不同月龄三转基因AD小鼠空间探索和记忆能力进行检测。利用免疫组织荧光染色技术检测小鼠脑内胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达及分布。Westem blotting检测不同月龄小鼠海马组织GFAP和白细胞共同抗原（CD4S）及自噬水平标志物——微管相关蛋白1轻链3（LC3）表达水平的变化。 结果 （1）Morris水迷宫检测结果提示：随着月龄的增加,小鼠的逃避潜伏期显著增加。与2月龄小鼠相比,6月龄小鼠的逃避潜伏期开始显著增高,12月龄小鼠的逃避潜伏期最长,差异均有统计学意义（P＜0.05）。同时,随月龄增加,各月龄小鼠跨越原平台次数呈递减趋势,在原平台所在象限停留时间也显著降低。（2）免疫组织荧光染色及Western blotting结果提示：与野生型4月龄小鼠相比,8、12月龄小鼠海马区GFAP表达显著增加;同时8月龄较2月龄三转基因小鼠GFAP表达也显著增加,差异均有统计学意义（P＜0.05）。12月龄三转基因小鼠较4月龄野生型小鼠CD45表达显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。而2月龄开始,三转基因小鼠海马区LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ即显著增高,4月龄时进一步增加,与野生型小鼠比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论 随着疾病的进展,三转基因AD小鼠学习和记忆能力逐渐下降,炎症反应显著增高,而自噬水平呈现出先增高后降低的趋势。

脂联素改善阿尔茨海默病模型小鼠焦虑情绪及工作记忆

目的:探讨脂联素(APN)预处理对9月龄三转基因阿尔茨海默病(3xTg-AD)模型小鼠学习记忆能力和焦虑情绪的影响。方法:选取9月龄3xTg-AD小鼠及C57BL/6J小鼠,分为4组:WT+Saline组、3xTg-AD+Saline组、WT+APN组和3xTg-AD+APN组,每组8只。将全部小鼠进行侧脑室埋管术后,恢复7 d,在自由清醒状态下分别经侧脑室给予生理盐水或APN,采用旷场、新物体识别及Y-迷宫3种行为学手段检测小鼠的情绪及学习记忆能力。结果:(1)在旷场实验中,与WT+Saline组小鼠相比,3xTg-AD+Saline组小鼠在中央区域的活动时间明显缩短,在外周区域的活动时间明显延长,给予APN后可有效逆转3xTg-AD小鼠的该现象,表明脂联素可有效缓解3xTg-AD小鼠的焦虑情绪。(2)新物体识别实验中,3xTg-AD+Saline组小鼠的辨别指数为(-16.7±10.1)%,明显低于WT+Saline组的(18.0±8.2)%(P<0.01)和3xTg-AD+APN组的(15.7±8.8)%(P<0.01),表明脂联素可明显改善3xTg-AD小鼠的识别记忆能力损伤。(3)Y-迷宫实验中,3xTg-AD+Saline组小鼠的自发交替正确率为(40.0±1.7)%,明显低于WT+Saline组的(56.6±4.6)%(P<0.01)和3xTg-AD+APN组的(53.9±5.6)%(P<0.01),表明脂联素能够逆转3xTg-AD小鼠工作记忆能力的损伤。结论:脂联素可以改善9月龄3xTg-AD小鼠的焦虑情绪及识别记忆和工作记忆能力损伤,可能在AD的预防和治疗中发挥有效作用。

Aβ在APP/PS1双转基因与APP/PSl/Tau三转基因阿尔茨海默病模型小鼠脑海马区分布的比较研究

目的:比较研究Aβ免疫阳性产物在老年APP/PSl双转基因(2xTg)与APP/PSl/Tau三转基因(3xTg)阿尔茨海默病模型小鼠海马的分布。方法:采用15月龄2xTg与同龄3xTg,分别进行Aβ单克隆抗体6E10免疫组化检测Aβ阳性神经元及斑块。结果:在海马区2xTg组Aβ沉积多发生于细胞外,形成大量Aβ阳性斑,而3xTg组则主要沉积于细胞内。结论:这种Aβ分布的差异可能与3xTg模型早期即有神经元丢失有关。

小檗碱对三转基因阿尔茨海默病小鼠的学习记忆和海马PSD95突触相关蛋白表达水平的影响

目的探讨小檗碱(BBR)对三转基因阿尔茨海默病(AD)小鼠的学习记忆及海马组织PSD95突触蛋白表达水平的影响。方法将30只三转基因(APP/Tau/PS1)AD小鼠按随机数字表法分成3组,即AD对照组、AD+25 mgBBR组、AD+50 mgBBR,每组各10只,后2组以灌胃方式且剂量分别为25 mg·kg^(-1)·d^(-1)、50 mg·kg^(-1)·d^(-1),对照组给予等剂量生理盐水连续3个月灌胃处理;采用Morris水迷宫方法探测各组AD小鼠行为学改变、空间记忆及探索情况;免疫荧光染色检测各组小鼠海马组织突触后致密蛋白95(PSD95)阳性表达水平;Western blotting(WB)法检测各组三转基因AD小鼠海马脑组织PSD95蛋白、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表达水平及微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)自噬水平。结果 AD+25 mgBBR组的逃避潜伏期的学习记忆能力、免疫荧光PSD95表达水平以及PSD995、LC3-Ⅱ、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平与AD对照组比较均有明显差异(P<0.05);AD+50 mgBBR组逃避潜伏期的学习记忆能力、免疫荧光PSD95表达水平以及LC3-Ⅱ、p-Akt、p-mTOR表达水平与AD对照组比较差异均更明显(P<0.05,P<0.01)。结论应用50 mg小檗碱能较好改善三转基因AD小鼠的学习记忆、空间探索能力,其机制可能是通过增加自噬水平LC3-Ⅱ调控Akt/mTOR信号通路,增加突触蛋白PSD95的表达水平及突触数量,以改善AD相关临床症状。

不同β-淀粉样蛋白抗体含量的IVIG对阿尔茨海默病模型小鼠认知功能干预效果初探

目的 探讨市售不同β-淀粉样蛋白(Aβ)抗体含量的静注免疫球蛋白(IVIG)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠认知功能的干预效果。方法 选取市售的国内8个不同血液制品公司的IVIG(IVIG1~8),酶联免疫吸附(ELISA)法检测其Aβ_(40/42)抗体含量后,按高、中、低分为3种Aβ_(42/40)抗体水平的IVIG做动物干预实验:将40只3月龄三转基因AD(3xTg-AD)小鼠随机均分为4组,雌雄各半,实验组(实验组1~3)分别腹腔注射高、中、低3种Aβ_(42/40)抗体水平IVIG(1 g·kg^(-1)剂量、2次/周,持续12周),对照组等量生理盐水腹腔注射。注射24次后立即利用小鼠行为学分析系统对4组小鼠做认知行为学检测及分析。结果 8种国内不同厂家生产的IVIG Aβ抗体含量(μg/mL)差异较大,Aβ_(40)单体抗体为0.7±0.05~3.1±0.05、Aβ_(40)寡聚体抗体为11.7±0.7~32.0±2.2、Aβ_(42)单体抗体为1.8±0.1~27.9±0.3、Aβ_(42)寡聚体抗体为2.3±0.1~49.4±2。从高、中、低Aβ_(42/40)抗体水平的IVIG中各选择1种(IVIG-1、IVIG-8、IVIG-6)分别注射给3个实验组小鼠;不同IVIG干预后实验组1~3组与对照组小鼠认知行为检测分析:旷场试验中进入中心区域时间(s)分别为0.5±0.9、23.4±6.1(P<0.01)、4.6±2.8、2.6±2.3,粪便数量(粒)分别为1.6±0.7、1.2±0.4、2.4±0.5、3.8±0.8(P<0.01);新物体识别试验:探索新物体分值分别为71.3±29.5、71.8±20.5、75.9±26.9、25.6±23.7(P<0.05);巴恩斯迷宫试验:实验组2与对照组小鼠探索目标洞时间(min)在d6为(50.3±19.3 vs 21±14.6(P<0.05)、d13为58.2±20.9 vs 19.2±15.9(P<0.05),其他各实验组与对照组相比无明显变化。结论 目前市售的产自国内的IVIG制品的Aβ_(40)/_(42)抗体水平存在明显差异;3月龄3xTg-AD小鼠经过其连续干预3个月后,认知功能均有所改善,改善效果与IVIG中Aβ抗体有关,但与抗体浓度不呈正相关。

三重转基因阿尔茨海默病动物模型的神经再生研究

目的探讨不同鼠龄 APP/PS1/Tau 三重转基因阿尔茨海默病小鼠(3xTg-AD)室管膜下层(Subventricular zone,SVZ)及海马齿状回(dentate gyrus,DG)神经细胞增殖变化及与β淀粉样斑块的关系。方法采用3月龄和12月龄 A PP/PS1/Tau 三重转基因小鼠(3xTg-AD)作为实验组,同龄同种系野生型小鼠作为对照组,BrdU 标记增殖细胞。Doublecortin(DCX),BrdU 免疫荧光双标染色未成熟神经细胞,计数室管膜下层和海马齿状回 BrdU 阳性细胞数和 DCX/BrdU 双标阳性细胞数。免疫组化法检测β淀粉样斑块。结果 12月龄组3xTg-AD 小鼠与对照组野生型小鼠相比,室管膜下区及海马齿状回 BrdU 阳性细胞明显减少(P<0.05),3月龄组无明显差异(P>0.05)。3月龄组3xTg-AD 小鼠未见β淀粉样斑块形成,12月龄组3xTg-AD 小鼠有明显的β淀粉样斑块形成。结论 12月龄3xTg-AD 小鼠室管膜下层及海马齿状回脑内神经再生能力明显下降,与β淀粉样斑块形成可能相关。

脂联素改善阿尔茨海默病模型小鼠焦虑抑郁样行为的分子机制

目的探讨脂联素(adiponectin,APN)对三转基因阿尔茨海默病(3xTg-AD)模型小鼠焦虑和抑郁样行为的影响及机制。方法9月龄3xTg-AD小鼠和野生型(WT)小鼠随机分为WT给生理盐水(WT+Saline)、WT给药(WT+APN)、3xTg-AD给生理盐水(3xTg-AD+Saline)和3xTg-AD给药(3xTg-AD+APN)四组,每组8只,在自由清醒状态下对两种小鼠经侧脑室慢性给予生理盐水(Saline)或APN。采用高架十字迷宫实验检测小鼠的焦虑情绪、糖水偏好及悬尾实验检测小鼠的抑郁情绪,Western blot检测海马组织p-AMPK、AMPK、p-GSK-3β(Ser9)、GSK-3β和SIRT1表达水平。结果在高架十字迷宫实验中,3xTg-AD+Saline组小鼠在开放臂停留时间百分比为[(4.2±2.7)%],明显低于WT+Saline组小鼠的[(10.1±4.1)%](q=4.349,P<0.01)和3xTg-AD+APN组小鼠的[(9.7±3.3)%](q=4.065,P<0.01)。在糖水偏好实验中,3xTg-AD+Saline组小鼠的糖水偏好率为[(48.8±5.3)%],明显低于WT+Saline组的[(60.9±6.7)%](q=4.522,P<0.01)和3xTg-AD+APN组的[(59.3±6.2)%](q=3.911,P<0.05)。在悬尾实验中,3xTg-AD+Saline组小鼠的不动时间百分比为[(40.7±9.9)%],明显高于WT+Saline组的[(27.1±4.8)%](q=5.257,P<0.001)和3xTg-AD+APN组的[(31.4±6.0)%](q=3.624,P<0.05)。Western blot检测结果显示,四组小鼠海马组织的AMPK和GSK-3β的相对蛋白表达水平没有差异。但与WT+Saline组相比,3xTg-AD+Saline组小鼠海马组织中的p-AMPK(q=3.586,P<0.05)、p-GSK-3β(Ser9)(q=3.125,P<0.05)和SIRT1(q=3.044,P<0.05)的表达水平均明显降低。与3xTg-AD+Saline组小鼠相比,3xTg-AD+APN组小鼠的p-AMPK(q=3.374,P<0.05)和p-GSK-3β(Ser9)(q=3.063,P<0.05)表达水平上调,但SIRT1表达水平差异无统计学意义。结论脂联素可以通过上调海马组织的p-AMPK和p-GSK-3β(Ser9)表达水平有效缓解9月龄3xTg-AD小鼠的焦虑和抑郁样行为。