基于三重实时荧光聚合酶链反应构建黄牛和牦牛源性成分同步检测方法

目的建立一种拥有内源质控的三重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,用以快速鉴定肉和乳中黄牛和牦牛的源性成分。方法首先对黄牛肉、牦牛肉、黄牛奶、牦牛奶等7种动物产品进行特异性检测,同时通过稀释梯度方法验证此方法的绝对检出限(limit of detection,LOD),最后通过黄牛和牦牛肉掺假模拟试验确定该方法的相对灵敏度。结果该方法的特异性强,能特异性地检测到来源于黄牛和牦牛肉和乳的DNA,稳定扩增的内源质控有效地避免了假阴性结果,本方法针对黄牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10‒3 ng,针对牦牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10^(‒2)ng,本方法对黄牛肉和牦牛肉混合肉的相对灵敏度可达0.1%牦牛肉。结论所建立的三重实时荧光PCR方法特异性强、灵敏度高,可实现黄牛和牦牛源性以及内源质控的同步检测,又能通过内源质控排除实验假阴性结果。

聚合酶键式反应生物芯片/微装置的实时定量荧光检测

以微电子机械系统技术而发展起来的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Re-action,PCR)生物芯片/微装置,由于具有所需样品和反应混合物体积少,反应速度快以及集成化程度高等优点而日益引起人们的重视。实时定量PCR是利用能特异标记PCR产物的荧光染料来动态显示PCR产物的累积,从而得到PCR扩增曲线的技术。本文介绍了实时定量检测技术及其在PCR生物芯片/微装置中的应用。

多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆

采用多重实时荧光PCR技术,对大豆筛选基因35S启动子(cauliflower mosaic virus,CaMV 35S)、NOS终止子(nopaline synthase,NOS)和内源基因Lectin设计合成了多对检测引物和探针,在筛选各基因合适的检测引物和探针的基础上,摸索引物组合和扩增条件,最终确定合适的探针引物组合和试验条件,建立转基因大豆快速初筛技术。该方法可在1 h内同时完成对转基因大豆3个基因片段的实时荧光PCR检测。方法特异性强,灵敏度高,可用于大豆转基因成分的快速检测,大大提高检验效率,可为消费者的食品安全及我国大豆的进出口检验提供有效的技术支持。

双重实时荧光定量PCR检测人维生素D受体的方法学构建

目的 建立单管检测人维生素D受体（VDR）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的双重实时荧光定量聚合酶链反应（dual real-time PCR）的方法。方法 以GAPDH基因为内参,采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物及Taq Man探针,进行PCR扩增检测VDR基因。将VDR及GAPDH扩增产物片段纯化后克隆构建成重组质粒,作为定量检测基因表达的标准品,并用于分析该方法的灵敏度和重复性。结果 PCR扩增产物经测序分析证实为VDR及GAPDH特异性片段;该方法检测VDR与GAPDH灵敏度达40拷贝/μL;线性范围为4.00×10~1~4.00×10~5拷贝/μL;决定系数R2分别为0.998、0.999;扩增效率E分别为96.10%、85.15%;批内变异系数（CV）分别为0.09%~1.21%、0.35%~0.88%;批间CV分别为0.17%~0.51%、0.51%~2.46%。结论 成功建立了单管检测人VDR及GAPDH的双重实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好、灵敏度高、可快速高通量检测VDR的相对表达量,有效缩短时间,减小实验误差。

梨火疫细菌实时荧光PCR和诱捕PCR-ELISA检测方法的建立

根据梨火疫细菌中独特而保守存在的质粒pEA2 9,设计了 1对引物和 3条探针 ,建立了实时荧光PCR检测方法和诱捕PCR ELISA检测方法。实时荧光PCR采用带荧光标记的核酸杂交探针 ,边扩增边检测 ,步骤简单 ,不需PCR后处理 ,可避免假阳性和交叉污染 ;诱捕PCR ELISA检测方法只需简单处理的样品就能检测 ,减少了核酸不纯出现的漏检 ,由于增加了核酸杂交探针 ,可不需凝胶电泳EB染色检测 ,不会出现假阳性问题。

实时荧光定量PCR技术在本科实验教学中的应用探讨

针对农林专业教学的特点,设计了“实时荧光定量PCR分析不同氮肥施用量下烟叶团棵期叶片中NtCIPK8的定量表达”实验,使学生了解不同施氮量下,相同组织中同一个基因的表达量不同的知识,还将基因表达的特点从一个抽象的概念转化为了具体的数字图形,同时使学生可以掌握实时荧光定量PCR技术的原理、方法和仪器的使用,为增强农林专业学生的科研能力和综合素质提供了新的内容。

生物肥料中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌多重荧光PCR鉴定方法的建立

建立并优化微生物肥料中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的多重实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法,评价此方法的特异性,并对实际样品进行检测。结果显示,该方法特异性良好,为微生物肥料中菌种鉴定提供技术支撑。

食品接触材料中3种致病菌的多重荧光PCR检测

建立并优化食品接触材料中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌3种致病菌的多重实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,评价此方法的特异性和灵敏度,并模拟阳性样品进行检测。结果显示,该方法特异性良好,检测灵敏度均能达到10~3 CFU/mL,为食品接触材料的微生物检测提供技术保障。

饲料微生物添加剂中地衣芽孢杆菌实时荧光PCR检测

建立饲料添加剂中地衣芽孢杆菌实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,评价此方法的特异性和灵敏度,并经实际样品检测。结果显示,该方法特异性良好,检测灵敏度均能达到103 CFU/mL,可用于饲料添加剂中地衣芽孢杆菌的快速检测。

实时荧光定量PCR技术在动物遗传育种中的应用

聚合酶链式反应技术（polymerasechainreaction简称PCR）是一项体外基因快速扩增技术。该技术的建立，使定性检测的技术得到改善，达到检测单个靶细胞的水平，以其简便易行、灵敏度高等优点被广泛应用于分子生物学及医学等领域。但其易污染、假阳性及定量不准确等问题也日益突出。而荧光定量PCR技术（FQ—PCR）的出现解决了以上难题，实现了从定性到定量的飞跃。此方法特异性强和可靠性更强，能实现多重反应，且采用完全闭管检测，不需要PCR后处理，有效解决PCR污染问题以及EB对试验人员的伤害；

小尾寒羊不同生长阶段肌球蛋白与肌球蛋白重链相关基因的变化

为研究不同生长阶段小尾寒羊股二头肌中肌球蛋白与肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)异构体相关基因的内在变化规律,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术对自然放牧条件下1~18月龄小尾寒羊股二头肌MyHC进行分离,测定其相关基因的相对表达量。结果表明:小尾寒羊股二头肌中肌球蛋白含量总体呈现上升趋势,9月龄达到最大值;MyHCⅠ基因相对表达量随着月龄的增加呈现下降趋势,MyHCⅡa基因相对表达量与月龄呈正相关,MyHCⅡb基因相对表达量总体呈现先减后增的趋势,MyHCⅡx基因相对表达量9月龄最低,12月龄最高;MyHCⅠ基因相对表达量在6~9月龄变化较大,说明6~9月龄生长变化较快,9~12月龄变化较小,说明9~12月龄生长缓慢。

中科院长春光机所在光电一体化芯片PCR领域取得进展

作为基因检测的金标准,聚合酶链式反应(PCR)技术是一种重要的疾病检测工具。目前,众多疾病的临床检测均采用实时荧光PCR(RT-PCR)技术作为核心手段。但是,RT-PCR技术在灵敏度、检测限、分析成本以及基层诊断疾控普及等方面也存在着诸多不足。中国科学院长春光学精密机械与物理研究所应用光学国家重点实验室研究员吴文明在长春光机所率先开展了聚合酶链式反应技术研究。

金钱白花蛇、乌梢蛇、蕲蛇的三重PCR鉴定方法的建立

目的:建立金钱白花蛇、乌梢蛇、蕲蛇的三重聚合酶链式反应(PCR)鉴别方法。方法:以线粒体Cytb基因为靶基因,设计特异性引物,优化引物最适退火温度与最佳浓度比,并用该方法进行混合样品的检测。结果:金钱白花蛇、乌梢蛇与蕲蛇的引物(浓度均10μmol·L^(-1))在57℃时特异性均非常好,最佳浓度比为0.6∶1.0∶1.8时分别扩增出185、235、343 bp的特异性条带,混淆品及空白对照无条带。该方法能同时、准确地鉴定出混合样品的蛇源成分。结论:本方法可同时、准确、快速地鉴定金钱白花蛇、乌梢蛇和蕲蛇样品,并适合粉末样品鉴别。

基于实时荧光定量PCR技术的当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量测定方法的开发及比较

目的:对当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的变化情况进行定量分析。方法:建立了实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR),对不同产地、不同收集企业、不同储藏时间当归饮片中金黄色葡萄球菌进行定量分析。荧光定量反应体系为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10μL,正向引物、反向引物(10μmol·L-1)各0.8μL,模板/基因组DNA 1μL,双蒸水7.4μL。荧光定量反应条件为①扩增曲线:94℃预变性30 s,94℃变性10 s,60℃退火12 s,72℃延伸30 s,循环45次,72℃单点检测信号;②熔解曲线:72℃开始检测,以0.5℃为台阶温度停留15 s采集荧光。根据Real-time PCR的测定结果,分别从生当归、酒当归和土炒当归中选择具有代表性的样品进行平板计数法测定,并与Real-time PCR检测结果进行比较。结果:不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量排序为生当归>土炒当归>酒当归;在不同产地的当归饮片中均以甘肃渭源地区样品所含的金黄色葡萄球菌含量为最低;与零售企业相比,生产销售企业的生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量较低;不同储藏时间对生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量有一定的影响,随储藏时间的增加,金黄色葡萄球菌的含量增加。对部分代表性样品进行检测时发现,平板计数法检测结果数量级较Real-time PCR低3~4个数量级。结论:建立的Real-time PCR的特异性、灵敏度、准确性以及报告周期均优于平板计数法,可为当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的快速、准确定量检测提供有效技术手段。

生物有机肥中枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌检测方法的建立

使用传统细菌生化鉴定或全自动微生物鉴定系统VITEK 2 compact难以区分枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌,因此建立鉴定微生物肥料中枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的多重实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法具有实际意义。对实际生物有机肥样品进行检测,结果显示,该方法特异性好,抗干扰力强,为生物有机肥中有效活菌种类鉴定提供了技术支撑。

雷竹林土壤氨氧化微生物对不同肥料的响应

雷竹Phyllostachys violascens林冬季地表覆盖施肥为核心的集约经营技术被广泛推广应用,冬季覆盖以及施肥处理必将对土壤氨氧化微生物群落结构产生影响。为揭示雷竹林覆盖和施肥等集约经营措施对土壤氨氧化微生物的影响,进行了田间试验。设计如下2个试验:试验1为施用等量硝态氮复合肥:m(氮)∶m(五氧化二磷)∶m(氧化钾)=16∶16∶16的对照1(不覆盖)和处理1(覆盖);试验2为覆盖的4个不同肥料处理,分别为对照2(不施肥),处理1,处理2(尿素),处理3(尿素+氯化钾),各处理以含氮量360 kg·hm-2为标准折算成相应的肥料用量,氯化钾与复合肥等钾量折算。应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术和定量PCR技术分析土壤氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)群落结构多样性和功能基因丰富度。结果表明:不同处理土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌有较高比例的共性种类,群落结构尚未发生显著改变;前期未覆盖的对照1与其他前期曾覆盖的所有处理的氨氧化细菌群落结构差异相对较明显,同为前期覆盖的处理3与其他处理又稍有不同;土壤氨氧化细菌多样性为处理1明显高于(P<0.05)处理3;处理3氨氧化细菌和氨氧化古菌的基因的丰度均较高(P<0.05)。综合比较不同处理氨氧化细菌和氨氧化古菌的DGGE条带的多样性以及定量分析得出结论,处理3的氨氧化微生物多样性和功能基因最丰富,处理2最差。建议生产上采用尿素与氯化钾搭配施用,有利于土壤氨氧化微生物的活动和氮素循环利用。

滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达

目的:克隆滇重楼皂苷类成分生物合成途径中关键酶糖基转移酶基因(PpUGT1,PpUGT7),并对其进行生物信息学分析、相对表达量分析和原核表达。方法:试剂盒法提取滇重楼RNA并反转录,根据滇重楼转录组数据设计特异性引物,克隆基因全长,使用软件对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测基因相对表达量,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。结果:PpUGT1和PpUGT7分别长1 827 bp和1 380 bp,分别编码608和459个氨基酸,相对分子质量分别为67.6 kDa和51.3 kDa,其中PpUGT1预测为甾体类糖基转移酶,PpUGT7预测为三萜类糖基转移酶。两蛋白均为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽,均与同类蛋白具有较高的保守性。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)结果显示,PpUGT1的表达量由高到低依次为根>叶>花>茎,PpUGT7的表达量由高到低依次为茎>叶>花>根。此外,成功在大肠埃希菌中以可溶形式表达目的蛋白。结论:克隆得到PpUGT1和PpUGT7基因,证明其在不同植物器官中存在差异表达,并在大肠埃希菌中成功表达其重组蛋白,为进一步鉴定PpUGTs功能、解析滇重楼中皂苷类成分生物合成途径奠定基础。