三重实时荧光RT-PCR检测三种鱼类弹状病毒的研究

鱼传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus IHNV)、鱼病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus VHSV)和鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus SVCV)是同属弹状病毒科(Rhabdoviridae)的3种鱼类病毒,也是影响水产养殖业的3种重要病毒。通过对这3种病毒基因序列的分析,在病毒基因的高保守区域,设计了3条分别针对这3种病毒的Taqman MGB探针,并选择3种无相互干扰的荧光基团进行标记。以此为基础建立针对该3种病毒的三重实时荧光RT-PCR的检测方法。通过反应条件的优化,该三重实时荧光RT-PCR最低可检测至102拷贝/反应的病毒量。同时,该方法还对病毒混合感染EPC细胞(Epithelioma papulosum cyprini)和攻毒斑马鱼进行了检测。实验结果表明,该方法是一种特异、灵敏、高效的病毒检测方法。

两种麻疹病毒和风疹病毒三重实时荧光RT-PCR检测试剂应用比较的研究

目的比较评价两种含内质控三重实时荧光RT-PCR检测试剂检测麻疹病毒和风疹病毒结果的差异。方法对江西省市级麻疹风疹实验室上送的麻疹病毒或风疹病毒核酸阳性咽拭子标本进行复核,同时用两种含内质控的麻疹病毒和风疹病毒三重荧光RT-PCR试剂盒检测,并对检测结果进行比较分析。结果麻疹病毒和风疹病毒核酸阳性咽拭子标本符合率分别为95.12%和100.00%;两种试剂检测麻疹病毒特异度和灵敏度均较好;试剂A和试剂B检测风疹病毒特异度较好,灵敏度分别为71.43%和100%;试剂A和试剂B检测人RNase P核酸灵敏度分别为100%和92.73%。结论试剂A在对麻疹病毒核酸检测方面具有较高的敏感度及特异度,有较高应用和推广价值。

猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能够快速检测猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒1型(FHV-1)的三重荧光定量RT-PCR方法,本研究根据FPV VP2基因、FCV ORF2基因和FHV-1 TK基因分别设计引物与探针,采用上述引物经PCR分别扩增上述3种病原的目的基因并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒标准品pMD18-T-FPV、pMD18-T-FCV和pMD18-T-FHV-1,并均经PCR和测序鉴定。将3种重组质粒标准品稀释到同一浓度1×10^(8)拷贝/μL,按体积比1∶1∶1混合后作为模板,采用方阵法优化各反应条件后,建立了检测上述病原的三重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。以FPV、FCV、FHV-1、猫博卡病毒、猫冠状病毒、猫支原体、猫白血病病毒、猫星状病毒的基因组为模板采用本研究建立的方法检测,评估该方法的特异性,结果显示,该方法仅能检测到FPV、FCV、FHV-1,而其他病原的检测结果均为阴性。选取1×10^(0)拷贝/μL~1×10^(6)拷贝/μL的混合质粒标准品和10^(-0.5) TCID_(50)/mL~10^(5.5) TCID_(50)/mL的混合病毒液分别作为模板,采用本研究建立的方法检测,评估该方法检测重组质粒和病毒的敏感性,结果显示,该方法对重组质粒标准品pMD18-T-FPV、pMD18-T-FCV和pMD18-T-FHV-1的检测限均为1.0×10^(1)拷贝/μL,对3种病毒的检测限均约为10^(0.5) TCID_(50)/mL;以1×10^(7)拷贝/μL、1×10^(5)拷贝/μL、1×10^(3)拷贝/μL质粒标准品混合物作为模板分别进行组内和组间的重复性试验,结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数(CV)均低于3%。利用建立的该三重荧光定量RT-PCR和常规PCR对81份临床样品(77份猫的眼、鼻、咽、肛混合拭子样品和4份组织病料样品)分别检测,结果显示三重荧光定量RT-PCR检测出47份FPV、13份FCV和13份FHV-1阳性样品,而常规PCR分别检测出39份FPV、9份FCV和6份FHV-1阳性样品,该三重荧光定量RT-PCR与FPV、FCV、FHV-1常规PCR的总符合率分别为90.12%、95.06%、92.59%。本研究建立的三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,为FPV、FCV、FHV-1临床样品的快速鉴别检测提供了有力技术支持。

PPRV、RVFV、SBV三重普通及实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用研究

为同时检测小反刍兽疫病毒(PPRV)、裂谷热病毒(RVFV)及施马伦贝格病毒(SBV) 3种外来动物疫病病原,根据GenBank相关病毒序列设计引物及探针,建立PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR及三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步应用于临床检测。结果显示:所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法可同步特异性检测PPRV、RVFV、SBV,检测敏感度可达10~3 copies/μL DNA;对临床症状相似的羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有扩增。所建立的PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法对PPRV、RVFV、SBV有特异荧光信号,检测敏感度可达10~(1.33)~10~(2.13) copies/μL DNA;而对临床症状相似羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、蓝舌病及鹿流行性出血热等病毒未有荧光信号。应用PPRV、RVFV、SBV三重实时荧光定量RT-PCR方法检测925份临床样本,检出一例PPRV阳性样本,经常规RT-PCR扩增及序列测定Blast确定为PPRV谱系IV型毒株。研究所建立的PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法和三重实时荧光定量RT-PCR方法可同步特异性检测3种病原,并初步应用于临床样本的检测。

基于三重实时荧光聚合酶链反应构建黄牛和牦牛源性成分同步检测方法

目的建立一种拥有内源质控的三重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,用以快速鉴定肉和乳中黄牛和牦牛的源性成分。方法首先对黄牛肉、牦牛肉、黄牛奶、牦牛奶等7种动物产品进行特异性检测,同时通过稀释梯度方法验证此方法的绝对检出限(limit of detection,LOD),最后通过黄牛和牦牛肉掺假模拟试验确定该方法的相对灵敏度。结果该方法的特异性强,能特异性地检测到来源于黄牛和牦牛肉和乳的DNA,稳定扩增的内源质控有效地避免了假阴性结果,本方法针对黄牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10‒3 ng,针对牦牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10^(‒2)ng,本方法对黄牛肉和牦牛肉混合肉的相对灵敏度可达0.1%牦牛肉。结论所建立的三重实时荧光PCR方法特异性强、灵敏度高,可实现黄牛和牦牛源性以及内源质控的同步检测,又能通过内源质控排除实验假阴性结果。

单增李斯特菌三重实时荧光PCR检测的建立及其毒力基因在分离菌株中分布

目的建立同时检测单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)溶血素基因hlyA、内化素基因inlA和磷脂酶C基因plcB的TaqMan-MGB三重实时荧光PCR检测方法,并对101株单增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB基因进行了检测,分析3个毒力基因在多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)聚类群组中的分布情况。方法根据单增李斯特菌毒力基因hlyA、inlA和plcB的保守序列设计引物和小沟结合物(minor groove binder,MGB)探针建立三重荧光PCR方法,对其特异性、灵敏度和可重复性进行了测试,并对分离的101株单增李斯特菌进行三重PCR检测。结果建立的三重实时荧光PCR方法特异于单增李斯特菌的检测,重复性良好,组内Ct值变异系数均小于1.5%,灵敏度可达100CFU/mL。对101株单增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB的检出率分别为98%、75%和98%。在可被MLST分型的89株菌株中,groupI的30株菌株有20株均缺失inlA基因;groupII的57株菌株中有56株三个基因均检出;groupIII的菌株hlyA、inlA和plcB三个基因均未检出。结论本文建立的三重实时荧光PCR方法能准确、快速、稳定的检测单增李斯特菌,101株单增李斯特菌的hlyA、inlA、plcB三个毒力基因的检出情况与单增李斯特菌的MLST分型聚类有较一致的关系,对分析单增李斯特菌毒力的强弱有重要参考意义。

林麝源化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌三重实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌,分别根据化脓隐秘杆菌plo基因、溶血性曼氏杆菌ICEMh1基因和肺炎链球菌pspC基因的特异性序列设计引物和探针,以重组质粒a.p-m.h1-s.p为标准品,通过优化反应条件,建立一种检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌三重实时荧光定量PCR方法,对其特异性、灵敏度和可重复性进行测试。结果表明,建立的方法对标准品阳性质粒的最低检测量为20拷贝,标准曲线在1.25×10^6 copies/μL^1.0×101 copies/μL范围内具有良好的线性关系。对2016年-2018年在陕西省收集的病料中化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌检出率分别为66.67%、5.5%和44.44%。建立的三重实时荧光定量PCR方法能快速、准确和稳定地检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌。

口蹄疫病毒通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感、特异的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)分型鉴别诊断实时荧光RT-PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测方法,根据O、A、AsiaⅠ三种血清型FMDV保守基因序列,设计能够检测到FMDV的特异性通用检测引物和A型检测引物,以及不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法,对123份疑似FMDV感染的临床样品进行了检测。结果显示,建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法在10~1～10~7拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;自123份疑似FMDV感染样品中,检出10份FMDV-T阳性,6份FMDV-T/FMDV-A双阳性并且与基因测序结果一致。结果表明,本研究建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法重复性好、敏感性高、特异性强,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,可用于FMDV的快速分型检测,为FMDV的早期检测及临床诊断提供了新方法。

几种外来动物病毒多重普通和实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用

为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在采集的临床样本检测中进行初步应用验证。结果显示:建立的PPRV/BTV8/EHDV1三重实时荧光定量RT-PCR检测方法仅对PPRV、BTV8和EHDV1有特异荧光信号,检测敏感度可达10^(1.70)~10^(2.08) copies/μL DNA;建立的PPRV/BTV8/EHDV1/AHSV四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测PPRV、BTV8、EHDV1和AHSV,检测敏感度可达10^(3) copies/μL DNA;2种方法对羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、牛病毒性腹泻等临床相似的病毒均无扩增。在925份临床样本中检测出1例PPRV核酸阳性样本;经核苷酸序列测定及BLAST比对确定为谱系Ⅳ型PPRV毒株序列。本试验所建立的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法和四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测相应的3种或4种病毒病原,且具有临床样本检测的应用潜力。

三重实时荧光PCR检测纯培养物和环境水体中霍乱弧菌方法的建立及应用

本研究建立了检测O1群、O139群、非O1和非O139群霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的三重实时荧光PCR方法,并进行纯培养物和环境水体标本的检测评价。根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列和霍乱弧菌种特异的溶血素编码基因hlyA序列设计引物和探针,利用荧光标记物,建立同时检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1和非O139群的三重实时荧光PCR方法,对所建立的方法分别进行了灵敏度和特异性评价,同时与传统培养法进行了比较。研究建立的方法能特异扩增出O1群、O139群、非O1和非O139群霍乱弧菌;而对其它8种弧菌没有扩增;实时荧光PCR检测252份环境水体标本的增菌液,与常规分离方法相比显示了较高灵敏度,所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。本研究可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查和纯培养物的确认。

三重实时荧光PCR法检测急性胃肠炎聚集性疫情的探讨

目的:探讨三重实时荧光PCR法在急性胃肠炎聚集性疫情中快速检测GⅠ/GⅡ型诺如病毒和A组轮状病毒的应用。方法:采集2020年11月12日一起学校急性胃肠炎聚集性疫情中的疑似病例、临床诊断病例、密切接触者标本及环境标本共373份,用三重实时荧光RT-PCR法同时检测诺如病毒(基因组GⅠ/GⅡ)和A组轮状病毒核酸,根据不同病毒核酸的检出率分析该疫情的主要病原体,分析病原体在感染者中年龄的分布影响。结果:373份标本中检出诺如病毒(基因组GⅠ/GⅡ)144份,检出率38.61%;检出A组轮状病毒2份,检出率0.54%;检出诺如病毒和A组轮状病毒混合感染6份,检出率1.61%。不同性别间诺如病毒感染阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。不同职业间诺如病毒感染阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。>45岁组人群诺如病毒感染阳性率最高,26~35岁组阳性率最低,不同年龄组人群阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:诺如病毒可能是导致本次疫情的主要病原体,同时存在诺如病毒和A组轮状病毒混合感染的情况,三重实时荧光PCR法同时检测多种病毒为疫情快速处置提供了实验室依据。

应用三重荧光RT-PCR方法检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒核酸

为了验证三重荧光RT-PCR方法检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒核酸的可行性,应用建立的方法分别检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒抗原,验证该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的方法检测临床样品。结果为,三重荧光RT-PCR方法能分别特异检出H5、H7和H9亚型禽流感病毒抗原。最低的检出限为H5亚型禽流感抗原(Re-11株)10-7的稀释度,变异系数(CV)为1.25%。检测100份鸡喉拭子,H5、H7亚型禽流感病毒核酸均为阴性,H9亚型禽流感病毒核酸13份阳性,阳性率为13.00%。结果表明,建立的三重荧光RT-PCR方法通过一个反应体系可以检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒核酸、具有快速、灵敏、特异的特点,适合对禽类的大规模监测。

多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆

采用多重实时荧光PCR技术,对大豆筛选基因35S启动子(cauliflower mosaic virus,CaMV 35S)、NOS终止子(nopaline synthase,NOS)和内源基因Lectin设计合成了多对检测引物和探针,在筛选各基因合适的检测引物和探针的基础上,摸索引物组合和扩增条件,最终确定合适的探针引物组合和试验条件,建立转基因大豆快速初筛技术。该方法可在1 h内同时完成对转基因大豆3个基因片段的实时荧光PCR检测。方法特异性强,灵敏度高,可用于大豆转基因成分的快速检测,大大提高检验效率,可为消费者的食品安全及我国大豆的进出口检验提供有效的技术支持。

同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法。结果显示,所建立的四重实时荧光RT-PCR方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×10^(3),1.13×10^(3),1.31×10^(2)和1.18×10^(2)拷贝;重复性好,组内和组间试验变异系数均小于4.5%。进一步应用所建立的同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法对199份采集自河北省不同地区腹泻猪的临床样品进行检测,结果检出23份PoRV阳性(11.56%)、12份PEDV阳性(6.03%)和1份TGEV阳性(0.50%),均为单一感染;未检出PDCoV阳性。本研究所建立的四重实时荧光RT-PCR检测方法可实现对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的同时鉴别检测,为实验室快速鉴别诊断猪病毒性腹泻提供了有效的技术支持。

三七鲨烯合酶基因在三七根、茎、芦头中的转录表达与三萜皂苷合成

三萜皂苷是三七、人参等重要药用植物的主要有效成分.采用改进的异硫氰酸胍法提取到三七RNA,经RT-PCR克隆技术获得三七三萜合成通路关键酶之一鲨烯合酶(squalene synthase,SS)cDNA,长1270 bp,读码框架编码415个氨基酸.比对分析表明,推衍的三七SS氨基酸序列与人参、积雪草、青蒿、拟南芥和水稻SS的一致性分别为98%、89%、81%、78%和71%.利用实时荧光定量RT-PCR技术对三七根、茎、芦头的SS转录表达研究发现,一年生三七根SS基因转录表达量最高,高于茎和芦头的表达;但总皂苷含量是:芦头>叶>根>茎.可能与SS之后其它三萜合成关键酶的活性差异或/和三萜合成后的定向输送及累积有关.

腺病毒、呼吸道合胞病毒和博卡病毒三重荧光RT-PCR快速检测的研究分析

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测腺病毒、合胞病毒和博卡病毒的方法。方法从Gen Bank随机下载腺病毒、合胞病毒和博卡病毒的目的基因,通过MEGA分析,利用Primer Express3.0软件设计三对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR来建立和优化反应体系。10倍稀释阳性对照,来检验建立体系的灵敏度和重复性。利用具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性。结果建立了一个单管对腺病毒、呼吸道合胞病毒和博卡病毒进行检测的三重荧光RT-PCR反应体系。该体系的检测灵敏度为102 copies/μl,扩增效率分别为92.24%、96.95%和99.70%,标准曲线的相关系数大于99%,重复性变异系数<3.5%,特异性实验未发现有非特异性扩增。结论建立的三重荧光可以快速、准确地检测腺病毒、合胞病毒和博卡病毒。

三阴性乳腺癌IL-17基因Real-time RT-qPCR检测法的建立与应用

目的:建立Real-time RT-qPCR(实时荧光定量RT-PCR)检测IL-17的方法,应用该方法检测三阴性乳腺癌(three negative breast cancer,TNBC)组织IL-17 mRNA的水平。方法:以TNBC组织为实验组,纤维腺瘤旁正常乳腺组织为对照组,并经HE染色病理分析确诊,Trizol法提取总RNA并反转录为c DNA。选β-actin作为内参,建立SYBR GreenⅠReal-time RT-qPCR检测法。利用该方法检测两组IL-17和β-actin的初始模板量,IL-17/β-actin计算IL-17 mRNA的相对表达量。结果:IL-17扩增效率为98.6%,相关系数0.997,溶解曲线为特异单峰,变异系数小于2.0%,IL-17 mRNA在TNBC组[(0.64±0.12)×10^(-2)]的相对表达高于正常对照组[(0.43±0.07)×10^(-2)],差异有统计学意义(P=0.025)。结论:成功建立了人源IL-17的Real-time RT-qPCR检测方法,TNBC组IL-17的高表达提示其可能与TNBC有一定关系,为研究TNBC的发病机制奠定了理论基础。

实时荧光RT-PCR法快速检测三带喙库蚊中的流行性乙型脑炎病毒

目的从四川省成都地区采集三带喙库蚊样品,快速检测蚊虫中的流行性乙型脑炎病毒（JEV）,并确定JEV基因型别。方法采用实时荧光RT-PCR方法检测蚊体内的JEV。利用一步法RT-PCR试剂盒扩增阳性样品Pr M区段特异性核苷酸序列,测序后应用Clustal X1.83和Mega 5.0软件构建系统进化树,并进行基因分型和同源性分析。结果 2012年采集三带喙库蚊雌蚊10 656只,分为219份,检测出7份JEV阳性核酸样品,阳性率为3.2%。扩增Pr M区域特异性核苷酸序列674 bp,经鉴定均为基因Ⅰ型。与国内外部分GⅠ型的相关序列比较,核苷酸同源性为91.5%~100%,氨基酸同源性为94.9%~100%,其中与四川省SC09-X08株同源性最高。结论实时荧光RT-PCR法能快速检测三带喙库蚊中的JEV,成都地区存在基因Ⅰ型JEV流行。

三种鱼类链球菌三重实时荧光PCR方法的建立

对3种链球菌基因序列的分析,设计了3条Taq Man探针,并选择3种无相互干扰的荧光基团进行标记。建立了三重实时荧光PCR的检测方法,同时对建立的方法进行了特异性、灵敏度、稳定性和重复性评价,并且与传统培养法进行了比较。结果显示,试验建立的方法能特异扩增出3种链球菌的标准阳性菌株;3种链球菌之间没有交叉反应;S.agalactiae的检测灵敏度约为1.52×10^1 CFU/mL;S.dysgalactiae的检测灵敏度约为1.33×10^2 CFU/mL;S.milleri的检测灵敏度约为1.76×10^1 CFU/mL;3种链球菌检测反应的CV值均小于5%;对采集的287份样品进行检测,共计检出5份S.agalactiae阳性样品、3份S.dysgalactiae阳性样品和1份S.milleri阳性样品与传统细菌分离鉴定的方法检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。

寨卡病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒三重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

本研究旨在建立寨卡病毒（ZIKV virus,ZIKV）、登革病毒（Dengue virus,DENV）以及基孔肯雅病毒（Chikungunya virus,CHIKV）三种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术。选用ZIKV的NS1基因、DENV的NS5蛋白基因以及CHIKV的E1蛋白基因作为靶标区域设计三组特异性引物探针,建立三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用ZIKV、DENV、CHIKV病毒体外转录RNA和病毒细胞培养物对该方法的灵敏性、特异性、重复性等方面进行评价,最后临床样本以及模拟标本验证。结果显示：三重实时荧光定量RT-PCR检测方法扩增效率均可达到90%以上,三种病毒体外转录RNA最低检测限均低于15拷贝/PCR,病毒培养物最低检出限均低于10PFU/mL且与单重检测方法无明显差异。与其他病毒无交叉反应,变异系数均在2%以内。临床标本及模拟标本检出率均可达95%以上。本研究建立的检测寨卡病毒、登革病毒以及基孔肯雅病毒的三重实时荧光RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于寨卡病毒病等相关临床标本的检测。