三种猪的肠道腹泻冠状病毒三重RT-PCR检测方法的建立与应用

为了同时检测引起猪只腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)和猪急性腹泻冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)这三种主要肠道冠状病毒,试验设计3对特异性引物,建立PEDV、PDCoV和SADS-CoV的三重RT-PCR方法,同时进行特异性、敏感性、重复性试验,并检测临床样品对方法进行验证。结果表明:采用建立的三重RT-PCR方法对PEDV、PDCoV和SADS-CoV进行扩增,分别扩增出大小约为486 bp、329 bp和628 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪传染性肠胃炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不能扩增出任何片段,特异性好;对PDCoV、PEDV和SADS-CoV的最低检测量分别为1×10^6,1×10^3,1×10^4 copies/μL,具有较好的敏感性;在196份临床样品中,PEDV的阳性检出率为13.27%,PDCoV为12.24%,SADS-CoV为0,同时多重RT-PCR与单项RT-PCR检测方法的符合率均为100%。说明建立的三重RT-PCR方法能够同时特异敏感、高效廉价检测出猪群中PDCoV、PEDV及SADS-CoV这三种肠道冠状病毒,具有快速、便捷和经济的特性,可用于临床大规模流行病学调查和诊断。

多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆

采用多重实时荧光PCR技术,对大豆筛选基因35S启动子(cauliflower mosaic virus,CaMV 35S)、NOS终止子(nopaline synthase,NOS)和内源基因Lectin设计合成了多对检测引物和探针,在筛选各基因合适的检测引物和探针的基础上,摸索引物组合和扩增条件,最终确定合适的探针引物组合和试验条件,建立转基因大豆快速初筛技术。该方法可在1 h内同时完成对转基因大豆3个基因片段的实时荧光PCR检测。方法特异性强,灵敏度高,可用于大豆转基因成分的快速检测,大大提高检验效率,可为消费者的食品安全及我国大豆的进出口检验提供有效的技术支持。

金钱白花蛇、乌梢蛇、蕲蛇的三重PCR鉴定方法的建立

目的:建立金钱白花蛇、乌梢蛇、蕲蛇的三重聚合酶链式反应(PCR)鉴别方法。方法:以线粒体Cytb基因为靶基因,设计特异性引物,优化引物最适退火温度与最佳浓度比,并用该方法进行混合样品的检测。结果:金钱白花蛇、乌梢蛇与蕲蛇的引物(浓度均10μmol·L^(-1))在57℃时特异性均非常好,最佳浓度比为0.6∶1.0∶1.8时分别扩增出185、235、343 bp的特异性条带,混淆品及空白对照无条带。该方法能同时、准确地鉴定出混合样品的蛇源成分。结论:本方法可同时、准确、快速地鉴定金钱白花蛇、乌梢蛇和蕲蛇样品,并适合粉末样品鉴别。

牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型三重RT-PCR检测方法的建立及应用

根椐GenBank中牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)和牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV-3)3种病毒基因序列,设计合成引物,建立3种病毒的三重RT-PCR方法。用这3对引物对同一样品中的BVDV、BRSV和BPIV-3核酸模板进行三重RT-PCR扩增,结果显示:可同时扩增BVDV的466 bp,BRSV的735 bp和BPIV-3的258 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10 pg的BVDV、1 pg的BPIV-3和10 pg的BRSV模板。用37份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示:两者的总符合率为100%。结果表明:建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。