脑震宁颗粒调节三重脑震荡大鼠线粒体能量代谢的机制研究

目的探究脑震宁颗粒调节三重脑震荡(MCC)模型大鼠海马组织线粒体能量代谢的作用机制。方法取SPF级Wistar大鼠,通过“自由落体撞击法”制备MCC模型。将造模成功的大鼠分为模型组、吡拉西坦组和脑震宁颗粒低、中、高剂量组,另设正常组,每组8只。各给药组大鼠按吡拉西坦组0.324 g/kg,脑震宁颗粒低、中、高剂量组2.25、4.5、9 g/kg的剂量灌服相应药物,正常组和模型组给予等体积生理盐水,每天1次,连续14 d。检测大鼠运动探索能力和学习记忆能力;检测大鼠海马组织三磷酸腺苷(ATP)含量;观察大鼠海马组织线粒体结构变化;检测大鼠海马组织线粒体动力蛋白相关蛋白1(Drp1)、线粒体裂变蛋白1(Fis1)、线粒体融合蛋白1(Mfn1)、视神经萎缩蛋白1(Opa1)的荧光强度;检测大鼠海马组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF-1)、线粒体转录因子A(TFAM)、Wnt-3a、β-连环蛋白(β-catenin)的蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组大鼠的运动总路程、中央格进入次数、直立次数,新物体识别指数,海马组织线粒体ATP含量,Mfn1、Opa1的荧光强度及PGC-1α、NRF-1、TFAM、Wnt-3a、β-catenin蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),静止时间和海马组织Drp1、Fis1的荧光强度均显著升高(P<0.01);透射电镜结果显示,海马组织线粒体明显肿胀,嵴大量断裂、减少,部分线粒体膜内髓样变。与模型组比较,各给药组大鼠以上指标水平/含量均有不同程度的逆转,大部分差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);透射电镜结果显示,海马组织线粒体肿胀程度减轻,嵴少量断裂、减少,粗面内质网局部区域模糊断裂。结论脑震宁颗粒可以提高MCC模型大鼠的运动探索和学习记忆能力,修复神经元损伤,发挥神经保护作用;其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路,维持线粒体融合分裂平衡,促进线粒体生物合成相关。

一重和三重脑震荡大鼠脑固缩的神经细胞定量变化研究

目的建立一重脑震荡(PCC)和三重脑震荡(MCC)大鼠模型,通过计数固缩的神经细胞数目变化,观察PCC和MCC鼠脑的神经细胞病理学变化规律,以探讨MCC大鼠脑损伤的累加效应.方法用自制金属单摆式闭合性脑损伤打击装置复制PCC和MCC大鼠模型96只,随机分为PCC鼠l d、2 d、4 d、8 d、16 d、24 d组和MCC鼠l d、2 d、4 d、8 d、16 d、24 d组(n=6)共12个实验组,另设一正常对照组(n=6).运用HE组织化学染色、尼氏染色,对中隔断面的前额叶皮质(PFC)、梨状皮质(Pi)r、尾壳核(CPu)、伏隔核(AcbC)、终纹床核(BST);背侧海马断面的无颗粒细胞皮质(RSA)、海马CA1-4区、上、下齿状回、丘脑背外侧核(LD);脑干白质以及被盖区等15个脑区进行固缩神经细胞计数.结果大鼠PCC和MCC后绝大多数脑区的固缩神经细胞数目均呈明显上升改变,且MCC后PFC、Pir、CPu、BST、RSA、LD和上齿状回部位的MIG数目上升变化比PCC鼠更加显著(P<0.05).结论大鼠PCC和MCC后绝大多数脑区的固缩神经细胞数目均呈上升性改变,而且MCC后小胶质细胞的升高变化比PCC更加显著,为MCC具有累积性损伤效应提供了病理学依据.

一重和三重脑震荡大鼠脑小胶质细胞定量变化研究

目的建立一重脑震荡(PCC)和三重脑震荡(MCC)大鼠模型,通过计数小胶质细胞(microglia,MIG)数目变化,观察PCC和MCC鼠脑的MIG病理学变化规律,以探讨MCC大鼠脑损伤的累加效应.方法用自制金属单摆式闭合性脑损伤打击装置复制PCC和MCC大鼠模型96只,随机分为PCC鼠l d、2d、4 d、8 d、16 d、24 d组和MCC鼠l d、2 d、4 d、8 d、16 d、24 d组(n=6)共十二个实验组,另设一正常对照组(n=6).运用HE组织化学染色,对中隔断面的前额叶皮质(PFC)、梨状皮质(Pir)、尾壳核(CPu)、伏隔核(AcbC)、终纹床核(BST);背侧海马断面的无颗粒细胞皮质(RSA)、海马CA1-4区、上、下齿状回、丘脑背外侧核(LD);脑干白质以及被盖区等15个脑区进行MIG计数.结果大鼠PCC和MCC后绝大多数脑区(除前额叶皮质和海马)的MIG数目均呈明显上升改变,且MCC后AcbC、Pir、CPu、BST、RST、CA3、LD和上齿状回部位的MIG数目上升变化比PCC鼠更加显著(P<0.05).结论大鼠PCC和MCC后绝大多数脑区的小胶质细胞数目均呈上升性改变,而且MCC后小胶质细胞的升高变化比PCC更加显著,为MCC具有累积性损伤效应提供了病理学依据.

一重和三重脑震荡大鼠损伤后早期小胶质细胞变化的研究

目的 建立单纯性脑震荡（pure cerebral concussion,PCC）和三重脑震荡（multiple cerebral concussion,3MCC）大鼠模型,观察上述2种大鼠损伤后早期中隔冠状断面小胶质细胞的反应变化,探讨小胶质细胞（MG）在不同脑损伤后的病理变化规律.方法 （1）动物分组：成年健康SD大鼠30只,体重（260±20）g,随机分为正常组、PCC和3MCC模型组,各模型组再随机分为1d组、4d组二个观测点,各组含动物6只.（2）采用金属单摆闭合性脑损伤打击装置复制PCC、3MCC大鼠模型,其中PCC大鼠12只,3MCC大鼠12只.（3）采用抗CD11b抗体行免疫组化染色,用显微图像分析系统,对鼠脑中隔冠状断面的额顶叶皮质区（FrPa）、胼胝体（CC）、尾壳核（CPu）、侧脑室旁中央间隔区（MS-LV）等脑区的CD11b阳性细胞数进行观测分析.结果 （1）正常状态下,CD11b阳性细胞很少; （2） PCC、3MCC模型组中隔断面上述各脑区的CD11b阳性细胞数在伤后明显增加,与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）; （3） 3MCC组CD11b阳性细胞数的增加高于PCC组（P＜0.05）.结论 （1） PCC和3MCC伤后1～4 d中隔断面MG出现明显激活,提示MG参与了PCC和3MCC的伤后病理生理改变过程; （2）随损伤次数增加,CD11b阳性细胞数呈明显损伤累积性增加.

一重与三重脑震荡大鼠强迫游泳抑郁样行为变化研究

目的 探讨一重与三重脑震荡（cerebral concussion,CC）后不同时期强迫游泳实验（forced swimming test,FST）抑郁样行为结构变化特点.方法 成年SD大鼠24只,用自制单摆闭合式脑损伤机械打击装置撞击大鼠额顶部,建立一重和三重CC大鼠模型,符合损伤判断标准的损伤大鼠被随机分为一次性脑震荡PCC组、及打击间隔分别为24 h与48 h的三重脑震荡3MCC 24 h组和3MCC 48 h组,另设一正常对照组,每组8只大鼠.应用FST行为学实验在伤后第3天、7天、15天、30天四个时间点进行大鼠损伤后抑郁样行为结构变化检测.结果 （1）与对照组相比,各损伤组大鼠的爬壁行为频数显著下降,均差异有统计学意义（P＜0.05）,其中各损伤组下降最大的时间点是：PCC组在伤后30 d为（6.00±3.30）次,3MCC48 h组在伤后7d为（5.75±3.01）次,3MCC 24 h组在伤后7d为（3.25±1.28）次,且爬壁行为的频数按PCC组＞3MCC 48 h组＞3MCC 24 h组依次递减;（2）与对照组相比,3MCC 24 h和3MCC 48 h组大鼠的静止不动行为频数均明显上升,均差异有统计学意义（P＜0.05）,其中各损伤组上升最大的时间点是：3MCC 48 h组在伤后7d为（19.00±2.83）次,3MCC 24 h组在伤后7d为（22.00±4.04）次,PCC组仅在伤后第30天差异有统计学意义,即（16.75±3.62）次,静止不动行为上升程度依次为PCC组＜3MCC 48 h组＜3MCC 24 h组.（3）游泳行为在各组间比较均差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 一重与三重脑震荡大鼠损伤后出现不同程度的抑郁样行为,且三重CC重于一重CC、打击间隔短的重于打击间隔长的三重CC.

基于MAPK信号通路研究脑震宁对三重脑震荡模型大鼠海马神经元损伤的影响

目的 研究脑震宁对三重脑震荡模型(multiple cerebral concussion,MCC)大鼠海马神经元损伤的影响及其机制。方法 采用自由落体法制备MCC大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为吡拉西坦(0.16 g/kg)组和脑震宁低、中、高剂量(6.68、13.36、26.73 g/kg)组,各给药组ig相应药物,2次/d,连续给药14 d。造模前后进行水迷宫平台实验,观察大鼠学习记忆能力变化;采用ELISA法检测大鼠血清中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6水平,WST-1法检测血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,硫代巴比妥酸法检测血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;qRTPCR法检测大鼠海马组织p38、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(cJun N-terminal kinase,JNK)m RNA表达;Western blotting法检测大鼠海马组织p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK和p-JNK蛋白表达;采用苏木素-伊红(HE)、尼氏体染色以及透射电镜(TEM)法分别观察大鼠海马神经元病理、尼氏体及超微结构的变化。结果 与对照组相比,模型组大鼠逃避潜伏时间增加(P<0.01),固定象限停留时间百分比减少(P<0.01);血清中IL-1β、IL-6和MDA水平升高(P<0.05、0.01),SOD活性下降(P<0.01);海马组织p38、JNK和ERK mRNA表达水平均升高(P<0.01);海马组织p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK和p-ERK蛋白表达水平均升高(P<0.05、0.01)。与模型组相比,脑震宁组大鼠逃避潜伏时间减少(P<0.05、0.01),固定象限停留时间百分比增加(P<0.05、0.01);血清中IL-1β、IL-6、MDA水平降低(P<0.05、0.01),SOD活性升高(P<0.01、0.001);海马组织p38、JNK和ERK m RNA表达水平降低(P<0.05、0.01);脑震宁各剂量组海马组织p38、p-p38和p-ERK蛋白表达水平降低(P<0.01),脑震宁低、中剂量组JNK和ERK蛋白表达水平降低(P<0.05),脑震宁中、高剂量组p-JNK蛋白表达水平升高(P<0.01)。HE、尼氏染色结果显示,模型组神经元排列稀疏,数量减少,部分细胞核消失或核仁破裂,胞质内混浊,尼氏体颜色变浅;脑震宁组大部分神经元细胞形态较完整,核大而圆,着色浅,部分细胞出现核仁消失,尼氏体颜色增加。TEM结果显示,模型组神经元细胞体积缩小,核仁破裂分散,微丝排列紊乱,板层崩解、断裂甚至消失;脑震宁组神经元细胞核大,核膜完整,核仁偏移,线粒体内嵴结构清晰,微丝排列较模型组整齐,部分崩解。结论 脑震宁可能通过影响丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的激活改善MCC模型大鼠海马神经元损伤。

一次性与三重性脑震荡鼠八臂迷宫逆行性遗忘变化研究

目的运用八臂迷宫实验比较研究一次性与三重性脑震荡大鼠的逆行性遗忘变化情况,以探讨不同损伤次数脑震荡大鼠的认知变化情况。方法用金属单摆闭合性脑损伤打击装置,复制大鼠一次性脑震荡和三重性脑震荡模型,检测脑震荡后大鼠在八臂迷宫中的食物摄取量、进入有食物臂次数、进入有食物臂臂数和重复进入无食物臂的次数变化情况,以反映大鼠损伤前后参考记忆与工作记忆的改变。结果与正常组比较,一次性脑震荡和三重性脑震荡组在伤后食物摄取量、进入有食物臂次数、进入有食物臂臂数和重复进入无食物臂的次数均呈下降趋势,且三重性脑震荡组比一次性脑震荡组下降幅度更大,恢复时间更长。结论脑震荡后,大鼠出现逆行性遗忘,且随着脑震荡次数增加,遗忘恢复时间延长。

三重脑震荡模型大鼠海马神经元铁死亡的变化

目的观察三重脑震荡模型(multiple cerebral concussion,MCC)大鼠海马神经元铁死亡(ferroptosis)的情况。方法90只清洁级雄性Wistar大鼠,体质量(250±10)g,按照随机数字表法分为对照组(12只)和模型组(78只),模型组采用自由落体法撞击大鼠额颞叶部(每天1次,连续3 d)制备大鼠MCC模型。将造模成功的大鼠随机分为12 h组、24 h组、48 h组、72 h组、7 d组、14 d组,每组12只。采用平衡木实验检测大鼠运动协调功能;ELISA法检测大鼠血清谷胱甘肽(glutathione,GSH)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)及炎性因子白介素-1β(interleukin,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)含量;比色法检测海马组织铁离子含量;RT-PCR法和Western blot法检测海马组织谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、铁蛋白重链(ferritin heavy,FTH)和铁蛋白轻链(ferritin light,FTL)mRNA水平和蛋白含量;普鲁士蓝染色观察脑组织内铁沉积情况;透射电子显微镜法(transmission electron microscope,TEM)观察海马神经元及线粒体超微结构的变化。采用SPSS 24.0软件统计软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD检验。结果平衡木实验中各组大鼠平衡木通过时间和运动协调能力评分均差异有统计学意义(F=30.08,60.34,均P<0.05),其中48 h组大鼠[(87.00±4.74)s,(4.75±0.43)分]通过时间和运动协调能力评分明显高于对照组[(35.13±6.99)s,(0.75±0.23)分](均P<0.05)。各组大鼠铁离子总含量、Fe2+含量和Fe3+含量均差异有统计学意义(F=25.20,94.42,40.25,均P<0.05),其中48 h组海马组织Fe2+含量明显高于对照组[(10.17±0.05)ng/μL,(8.65±0.01)ng/μL](P<0.05)。在RT-PCR和Western blot结果中,各组海马组织GPX4、FTH、FTL mRNA水平和蛋白水平均差异有统计学意义(F=37.94,82.09,49.01,71.63,28.94,15.78,均P<0.05),其中24 h组GPX4[(1.09±0.01),(0.23±0.01)]和FTL[(1.60±0.03),(0.64±0.02)]mRNA表达和蛋白含量明显高于对照组[GPX4:(1.00±0.02)、(0.17±0.01),FTL:(1.00±0.04),(0.32±0.01)](均P<0.05),24 h组FTH[(0.24±0.03),(0.07±0.01)]mRNA表达和蛋白含量明显低于对照组[(1.00±0.01),(0.67±0.03)](均P<0.05)。在透射电子显微镜结果中,MCC后不同时间点大鼠海马神经元细胞缩小,核仁破裂,核膜不同程度皱缩,线粒体肿胀变形且有空泡存在,线粒体内嵴结构减少或消失。结论三重脑震荡模型大鼠的炎性反应和氧化应激水平升高,海马神经元出现铁死亡特征,尤其在24 h、48 h时最明显。