兔肠道球虫病三重PCR方法的建立与应用

为建立一种能同时检测兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫的三重PCR方法,试验首先根据GenBank中的兔穿孔艾美耳球虫Eper基因、黄艾美耳球虫Efla基因、大型艾美耳球虫Eman基因序列设计3对特异性引物,通过优化PCR反应的退火温度和引物浓度,建立一种用于检测兔肠道球虫病的三重PCR方法,然后对该方法的特异性、敏感性及重复性进行评价,最后分别采用该方法及单一PCR方法对82份临床样本进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:所建立的三重PCR方法的最佳退火温度为59.7℃,最佳引物(F/R)浓度为0.15/0.15,0.20/0.20,0.20/0.20μmol/L(Eper、Efla、Eman基因);该方法能特异性扩增出兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫三种兔球虫卵囊靶基因,而斯氏艾美耳球虫、大肠杆菌及沙门氏菌的检测结果为阴性;能够检测出穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫三种兔球虫卵囊基因组DNA的最低限值分别为6.0,6.4,8.0 pg,两种模板浓度组合(60,64,80 ng/μL和6.0,6.4,8.0 ng/μL)批内重复性试验和批间重复性试验所有重复均扩增出预期目的条带;临床样本中,该方法的单一球虫检出率为53.6%,两种球虫检出率为30.5%,三种球虫检出率为7.3%;除黄艾美耳球虫+大型艾美耳球虫的混合感染类型两种方法检测结果的符合率为91.8%外,其他感染类型两种方法检测结果的符合率均为100%,整体符合率为98.8%。说明成功建立了一种可用于检测兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫的多重PCR方法,该方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点。

PDCoV、PKV和MRV三重荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为了快速同步检测猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪嵴病毒(PKV)和猪呼肠孤病毒(MRV),参考GenBank中PDCoV M、PKV 5’UTR和MRV L1基因保守序列,设计了特异性引物和探针并优化了反应条件,建立了同时检测PDCoV、PKV和MRV的三重荧光定量PCR方法。该方法可特异性检出PDCoV、PKV和MRV,与PRRSV、CSFV、PCV2、PRV、PEDV、TGEV、RV等病原无交叉反应,3种病毒的最低检测量分别为2.7×10^(1)copies/μL、1.22×10^(1)copies/μL和1.26×10^(2)copies/μL,组内及组间变异系数为0.001~0.019。应用所建立的方法与行业标准及文献报道方法同时检测142份临床样本,结果显示与行业标准及文献报道方法阳性符合率为78%~94.92%。本研究建立的三重荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,为临床PDCoV、PKV和MRV的鉴别诊断和流行病学调查提供了快速敏感的技术手段。