卡氏肺孢子菌主要表面糖蛋白上游保守序列基因microRNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建和鉴定卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,PC)主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein,MSG)表达调控基因上游保守序列(Upstream conserved sequence,UCS)的microRNA表达载体,并在体外转染到PC中观察其对PC的抑制作用。方法:设计并人工合成针对PC MSG-UCS基因的1对microRNA序列并定向克隆到表达载体pcDNA^(TM)6.2-GW/EmGFPmiR上,序列正确的载体用脂质体转染PC细胞,RT-PCR检测其对PC MSG-UCS基因的抑制作用,扫描电镜观察PC的超微结构变化。结果:凝胶电泳和测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致,其在mRNA水平能明显抑制PC的表达并能破坏PC的超微结构。结论:PC MSG-UCS基因的microRNA表达载体pPC-UCSm构建成功,并能在体外抑制PC的表达。

中国耶氏肺孢子菌主要表面糖蛋白UCS基因分型研究

目的以主要表面糖蛋白上游保守区UCS基因对中国耶氏肺孢子菌进行基因多态性分析。方法用巢式PCR扩增127例耶氏肺孢子菌感染患者呼吸道标本中主要表面糖蛋白上游保守区UCS基因,通过DNA直接测序获得该基因的序列,并随机选取部分标本经过克隆测序,分析其UCS串联重复区序列的特征,并分析不同患者人群中基因多态性分布。结果共获得97例（占76.4%）患者标本的UCS基因序列,依据串联重复单元的数目、序列不同得到2~5个重复的7种基因型,其中基因型1,2,3（占68.04%）最为常见,其次为基因型1,2,3,3（占21.65%）。在6组患者中,基因型1,2,3亦最为常见。结论本研究获得了我国耶氏肺孢子菌UCS基因多态性的基础资料,为进一步分析耶氏肺孢子菌的遗传学、流行病学提供了依据。

microRNA沉默卡氏肺孢子菌主要表面糖蛋白基因对大鼠卡氏肺孢子菌肺炎的治疗作用

目的探讨靶向卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,PC)主要表面糖蛋白基因(Major surface glycoprotein gene,MSG)上游保守序列(Upstream conserved sequence,UCS)的microRNA重组质粒对大鼠卡氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystis cariniipneumonia,PCP)的治疗作用。方法将SD大鼠经腹股沟皮下注射地塞米松磷酸钠7周,制备大鼠PCP感染模型。将模型大鼠随机分为5组:microRNA重组质粒治疗组(M组)、磺胺药物治疗组(H组)、生理盐水对照组(C1组)、空载体质粒对照组(C2组)和模型对照组(C3组),其中M组和C1、C2组经尾静脉分别注射含microRNA重组质粒pPC-UCS、生理盐水和空载体,H组用磺胺药物灌胃治疗,C3组不做处理,每日1次,疗程为7 d。1周后吉姆萨染色,油镜下计数大鼠肺组织液印片中PC包囊数;HE染色,光镜观察肺组织病理改变;ELISA法检测大鼠血清中IL-10和IFNγ的表达水平;RT-PCR法检测肺组织中PC MSG-UCSmRNA的表达水平;电镜观察PC的超微结构。结果与C1、C2和C3组相比,M组和H组大鼠肺组织PC包囊数均明显减少(P<0.05),肺组织炎症较轻,大鼠血清IL-10的表达水平均显著降低(P<0.05),而IFNγ的表达水平显著升高(P<0.05),大鼠肺组织PC MSG-UCS mRNA的表达水平均显著降低(P<0.05);电镜观察显示,M组和H组PC包囊表面均出现破损,C1、C2、C3组未发现破损。结论 microRNA重组质粒pPC-UCS对大鼠PCP有明显的治疗作用,为治疗PCP提供了新的思路。