人类白细胞抗原G基因5’上游调控区多态性与慢性丙型病毒性肝炎病毒载量的关系

目的探讨人类白细胞抗原G(HLA-G)基因5’上游调控区(URR)多态性与慢性丙型病毒性肝炎(简称丙型肝炎)病毒(HCV)载量的相关性。方法回顾性分析2015年4—12月在大连市公共卫生临床中心(原大连市第六人民医院)住院并确诊为慢性丙型肝炎的195例患者的临床资料。收集患者血样并提取基因组DNA和病毒核酸,采用聚合酶链式反应扩增HLA-G 5’-URR,然后使用基因测序技术检测患者HLA-G 5’-URR的16个多态性位点,采用定量PCR方法测定患者血清HCV病毒载量,分析HLA-G基因5’-URR基因多态性与HCV病毒载量的关系。结果195例慢性HCV感染者HLA-G基因5’-URR的16个多态性位点中,-762C>T、-725C>G>T、-716T>G、-689A>G、-666G>T、-633G>A、insG540、-509C>G、-486A>C、-443G>A、-400G>A、-398A>G、-201G>A和-56C>T 14个位点不同基因型患者的HCV病毒载量差异无统计学意义(P>0.05),而-477C>G、-369C>A 2个位点不同基因型患者的HCV病毒载量差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示,-477C>G位点CG基因型的HCV病毒载量高于GG基因型(P<0.05),-369C>A位点AC基因型的病毒载量高于AA基因型(P<0.05)。结论HLA-G基因5’-URR-477C>G位点CG基因型的HCV病毒载量高于GG基因型,-369C>A位点AC基因型的HCV病毒载量高于AA基因型,可能与HLA-G的表达水平改变有关。

BoLA-DQB基因上游调控区多态性研究

通过PCR扩增和克隆测序,对BoLA DQB 基因上游调控区的多态性进行研究。对BoLA DQB 基因ex on2的14种等位基因上游调控区序列进行同源性比较,结果表明:每个DQB·exon2 等位基因均与2 种DQB URR相连锁,在14种BoLA DQB·exon2等位基因上游共检测到15种DQB URR序列。这些序列中均存在与基因表达调控有关的W box 、X box、Y box、CCAAT box以及类TATA box调控元件,且遵循严格的空间顺序。其中W box 、X box 、Y box及类TATA box是多态的,CCAAT box是保守的,在这些调控元件之间也存在多态座位。这些多态座位的存在有可能对结构基因的表达水平产生影响。

黑曲霉T21 glaA 5’上游调控区的两个蛋白结合因子及其靶序列

采用凝胶阻滞法从糖化酶高产株黑曲霉(Aspergillus niger)T21部分纯化的蛋白提取液中检测到与糖化酶基因(glaA)5＇cis调控区特异结合的两个蛋白因子,其一的靶DNA定位在glaA翻译起始点(ATG)上游-580～-509及-318～-254bp两个区域,另一蛋白因子的靶DNA定位在-809～-580区域.-580～-509序列含有“TATA”的重复结构,-318～-254序列富含“GC”以及-809～-580序列含有CCAAT的特点暗示此3片段及其所结合的蛋白因子在A.niger T21 glaA的表达调控中可能有重要作用.

密穗小麦(Triticum compactum Host.)α-醇溶蛋白基因5'上游调控区序列分析

本文根据已报道的α-醇溶蛋白基因5'上游调控区和编码区的保守序列,设计特异性引物,以5份密穗小麦DNA为模板,用PCR克隆的方法获得了51条α-醇溶蛋白基因5'上游调控区序列。对长度大于380 bp的19条序列进行了分析,发现19条序列均含有与基因表达相关的重要调控元件,包括胚乳基序元件TGTAAAG、GCN4类似元件ATGAGTCAT、CAAT框、AAA G基序、TA-TA框、GCN4类似基序ATGAC(T)GATCAT以及CAC-box,同时在序列中出现了AACA元件。序列比对表明,密穗小麦与普通小麦和乌拉尔图小麦α-醇溶蛋白5'上游调控区存在较为丰富的变异,遗传差异较大。对各序列的5'上游调控区进行聚类分析,结果发现基于调控区序列不能完全区分材料的种属,同时根据已知染色体位置的序列,可以看出上游调控区序列并未表现出染色体特异性。

满江红鱼腥藻glnA基因上游调控区的克隆及其序列分析

以满江红鱼腥藻（Ａａｃ）提取总ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ技术，扩增得到其谷氨酰胺合成酶基因（ｇｌｎＡ）上游区．经酶切得到４０９ｂｐ的片段，并将其连接到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡｋｓ＋上测序．将测序结果与Ａｎａｂａｅｎａ７１２０调控序列比较，有９８２％的同源性．在上游调控中也具有ｎｉｆｌｉｋｅ和Ｅ．ｃｏｌｉｌｉｋｅ启动子，值得注意的是，调节蛋白ＶＦ１的结合位点正好位于ｎｉｆｌｉｋｅ启动子上．所克隆的片段不但对蓝藻固氮、泌氨的基因调控研究具有意义，也对表达载体的构建具有实用价值．

新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型上游调控区DNA多态性分析

目的探讨新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV-16)上游调控区(upstream regulatory region,URR)的变异及其与新疆维吾尔族妇女宫颈癌发生的关系。方法从19份中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取DNA,以此DNA为模板,PCR扩增HPV-16 URR DNA片段,PCR产物直接测序或克隆后测序,分析新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织HPV-16 URR DNA多态性。结果PCR检测结果显示宫颈癌组织中HPV-16 URR阳性率为89．47％(17/19)；测序和序列分析表明,与HPV-16原型比较,HPV-16 URR核苷酸多处发生变异,URR在核苷酸水平上形成11种突变模式(XJU-1～XJU-11),XJU-1和XJU-4突变模式各占23．53％(4/17),其余各突变模式均占5．88％(1/17),各模式与HPV-16 URR原型比较,同源性在98．50％～99．68％之间。在各位点的突变中,7192位(G→T)、7520位(G→A)的突变(100％,17/17)在新疆地区趋于恒定,该两处突变在亚裔美洲型(AA)中普遍存在,与病毒感染及宫颈癌发生相关；7729位(A→C)、7843位(A→G)、7792位(C→T)的突变可显著提高启动子的转录活性；其余突变尚未见报道,部分突变为新疆地区分离的HPV-16 URR所特有。结论中国新疆南部HPV-16 URR基因发生变异,HPV-16 URR的突变与HPV-16的系统发生以及新疆维吾尔族妇女高发宫颈癌存在一定关系。

黑曲霉T21 glaA 5'上游调控区DNA与蛋白因子的相互作用分析

以糖化酶生产菌株黑曲霉T21（Aspergillus niger T21）的糖化酶基因（glaa）5＇cis调控区片段为探针,采用电泳迁移率变动分析（EMSA）法,从黑曲霉蛋白粗提液中检测到与glaA 5＇调控区特异结合的蛋白因子,并把其结合DNA定位在T21 glaA 5＇调控区的-374～-344,-484～-414以及-580～-540 bp 3个区段,且此3个结合DNA的片段在EMSA实验中呈现交叉竞争,表明这3个DNA区段可与同一个蛋白因子相结合.以-374～344 bp序列为探针的紫外交联实验表明,该蛋白因子的分子量（或亚基分子量）约为10ku.利用DNase I足印分析确定了此蛋白因子在前两个区段的精细结合部位,并对其结合序列的特性进行了分析.

人类白细胞抗原-G基因上游调控区单核苷酸多态性与重度子痫前期发病的关系

目的探讨人类白细胞抗原-G（HLA-G）上游调控区单核苷酸多态性与重度子痫前期发病的关系。方法选择2008年10月至2009年3月郑州大学第三附属医院妇产科住院的39例孕晚期重度子痫前期孕妇为病例组，另选择同期正常孕晚期孕妇43例为对照组，两组孕妇均为汉族居民。采用PCR测序技术对两组孕妇进行HLA-G基因上游调控区单核苷酸多态性的等位基因和基因型分析，分别比较两组孕妇间单核苷酸多态性位点的等位基因和基因型频率分布。结果（1）中国汉族孕妇中，HLA-G基因上游调控区－1179～－689位点之间共检测到8个单核苷酸多态性位点；（2）重度子痫前期组孕妇HLA-G基因－964位点基因型GG的频率为12.8%（5/39），显著低于对照组的37.2%（16/43），两组比较差异有统计学意义（P＝0.012）；重度子痫前期组孕妇HLA-G基因－964位点等位基因G的频率为38.5%（30/78），显著低于对照组的57.0%（49/86），两组比较，差异有统计学意义（P＝0.018）；（3）重度子痫前期组孕妇HLA-G －716位点基因型TT的频率为17.9%（7/39），显著低于对照组的41.9%（18/43），两组比较差异有统计学意义（P＝0.019）；重度子痫前期组孕妇HLA-G －716位点等位基因T的频率为39.7%（31/78），显著低于对照组的60.5%（52/86），两组比较差异有统计学意义（P＝0.008）；（4）HLA-G －1140A/T、－762C/T、－725C/G的基因型及等位基因在重度子痫前期组和对照组的分布差异无统计学意义（P〉0.05）。结论中国汉族孕妇中，HLA-G基因上游调控区部分单核苷酸多态性与重度子痫前期的发病有关，－964位点等位基因为G或基因型为GG、－716位点等位基因为T或基因型为TT时，发生重度子痫前期的风险会降低。

玉米黑粉菌cyp51基因上游调控区克隆及生物信息学分析

为探明玉米黑粉菌cyp51基因的表达调控机制,根据玉米黑粉菌cyp51基因cDNA的5′-序列,采用染色体步移技术,获得其5′-上游调控区序列,总长为490bp。利用NNPP分析软件预测转录起始位点,并采用TFSEARCH1.3软件分析转录因子结合位点。结果显示:转录起始位点位于上游134bp处;上游调控区不仅包含启动子的核心结构序列TATA盒(分别位于-30、-58、-318和-348bp处)和CAAT盒(分别位于-150、-161和-191bp处),亦包含多个转录因子结合位点,如AP-4、GATA-1、CdxA、Dfd和Oct-1等;在上游调控序列中嘌呤含量高,而且从-222bp处开始存在4个连续高嘌呤含量的热激转录因子特异性结合位点(HSE)。

鸡卵清蛋白基因上游调控序列的克隆及序列分析

应用PCR 技术从鸡肝脏基因组中克隆了1.1 kb 的鸡卵清蛋白基因上游调控序列,并进行了序列分析。结果发现,扩增产物只有2 个碱基发生了突变,其TATA 框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异,表明已成功地克隆了鸡卵清蛋白基因上游调控序列,这为应用卵清蛋白提取生物活性物质的转基因鸡的构建研究奠定了基础。

水稻淀粉分支酶基因5′上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻淀粉分支酶基因 (sbe1) 5′上游调控区中存在的顺式作用元件 ,我们将水稻sbe1基因翻译起始点 (ATG) 5′上游区 1.2kb(- 10 96～ +74bp)片段经过不同限制性内切酶消化及外切核酸酶ExoIII部分消化 ,得到 4个 5′端缺失的片段。将这些缺失片段分别与 gus基因编码区连接 ,构建成融合质粒 ,经土壤农杆菌 (Agrobacterium)介导引入水稻 ,定量测定转基因水稻植株未成熟种子中的 gus酶活力。结果表明 ,- 5 16～ +6 4bp的sbe1启动子片段可以驱动gus基因的高表达 ,其它 3个启动子片段 (- 10 96～ +74bp ,- 2 95～ +74bp ,- 146～ +6 4bp)驱动 gus基因表达的能力较低。推测在sbe1基因 5′上游区 - 5 16～ - 2 95bp片段中可能存在能使

牛α-s1酪蛋白基因5’端及上游区的克隆鉴定和部分序列分析

本文以PCR法克隆得到牛α-sl酪蛋白基因5'端800bp片段,并以该片段为探针,筛选了以EMBL3为载体构建的牛基因组文库,得到一个阳性克隆。酶切该克隆,并以牛α-s1酪蛋白基因5'端800bp片段及该基因cDNA为探针杂交,鉴定了该插入片段的方向,亚克隆了各相应酶切片段,制作了较为详细的限制酶图谱,并分析了该基因转录起始点前后部分序列。与该基因现有的资料比较,酶切图谱存在部分位点的差异,序列存在少量突变和缺失,在5'上游区均发现有内含子及外显子部分,且缺失均发生于有重复序列的部位。

鹅卵清蛋白基因5’端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鹅输卵管基因组中扩增出 1 2kb的鹅清蛋白基因 5’端调控区 ,将其亚克隆入phD18-T载体的多克隆位点 (标记为pOV) ,经酶切和测序鉴定 :扩增产物只有 3个碱基发生了突变 ,其TATA框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异 ,表明鹅清蛋白基因 5’端调控区可作为启动外源基因表达的调控序列 。

猪血清白蛋白基因5′端调控区的克隆与分析

根据已报道的hsa(人血清白蛋白基因)启动子序列设计了一对引物,以猪的基因组DNA为模板,采用PCR扩增出一条256 bp DNA片段,用Primer Premier5.0和Promoter Scan软件进行分析。结果表明,此序列为psa基因5′-端上游包括启动子在内的调控区,该区域含有一般启动子典型的CAAT-box、TATA-box等基本顺式作用元件。另外,还含有CTF/NF-1、CTF、APF、HNF-1、CP1等转录因子的结合位点。

青岛地区宫颈癌组织中HPV16多态性分析

目的探讨山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)上游调控区(URR)和E6基因序列多态性,病毒主要分支,以及他们与宫颈癌的相关性。方法从43例HPV16阳性宫颈癌组织中提取DNA,扩增URR及E6基因,进行序列测定。通过DNASTAR生物软件进行核苷酸和氨基酸序列的分析。结果所有标本URR测序结果均发生了G7521A位点突变;26例(60.5%)宫颈癌组织中检测到核苷酸位点C24T,A7730C和G7842A的联合突变,为另一突变热点。E6测序结果发现突变热点为T178G(D25E),突变率为65.1%(28/43);仅1例T350G突变(L83V)。AS型是最多见的病毒突变类型,占65.1%(28/43),其次为野生型(E-P)23.3%(10/43)。结论青岛地区妇女宫颈癌组织中HPV16URR突变热点为G7521A以及C24T,A7730C和G7842A的联合突变。HPV16E6突变热点为T178G,这些突变热点可能与宫颈癌发生发展有密切关系。AS和E-P原型是青岛地区宫颈癌组织中两种主要的HPV16分支。

中国荷斯坦牛BoLA-DRB3基因的mRNA表达研究

为揭示牛MHC-DRB3上游调控区多态对其表达调控作用,利用PCR-SSCP和DNA序列测定技术分析并建立BoLA-DRB3*exon2和BoLA-DRB3 URR之间的连锁关系。结合不同近端调控区与转录因子结合模式预测结果,选择3种不同上游调控序列的连锁组合,应用实时定量RT-PCR技术对牛MHC-DRB3基因mRNA相对表达量进行了验证分析。结果表明,上游调控区基因型为H17H17的BoLA-DRB3基因mRNA相对表达量显著高于(P<0.01)基因型H1H1及H5H6。初步证明上游调控区中的多态会引起结构基因表达量的变化。

推定的BB0462蛋白增强oppAⅤ启动子的转录活性

Borrelia burgdorferi基因组中BB0462 ORF编码一种由110个氨基酸组成的未知功能BB0462蛋白．使用推定的氨基酸序列在蛋白库中进行Blast比对以及推定蛋白的二级结构预测的结果都显示BB0462蛋白与YhaB家族的蛋白类似．共转化后β-半乳糖苷酶活性分析发现BB0462蛋白增强了B．burgdorferi lp54质粒携带的oppAⅤ上游调控区的转录活性，而对其他4个oppAⅠ～Ⅳ上游调控区调控区的转录活性没有影响．利用纯化的BB0462融合蛋白在体外分别与oppAⅠ～Ⅴ调控区DNA片段进行凝胶阻滞分析，发现BB0462蛋白仅与邻近oppAⅤ基因转录起始点的一段409bp上游调控区DNA结合．用未标记的oppAⅤ上游调控区DNA与DIG-标记的oppAⅤ上游调控区DNA竞争BB0462蛋白，使凝胶上的DNA迁移阻滞带完全消失．β-半乳糖苷酶活性分析和凝胶阻滞分析表明BB0462蛋白在oppAⅤ基因表达的转录调控中可能起重要作用．

宫颈癌组织中HPV16 URR基因多态性分析

目的 分析宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型（HPV16）上游调控区（URR）基因多态性.方法 收集宫颈癌组织标本25例,提取DNA作为模板,聚合酶链反应（PCR）扩增URR目的 片段,扩增产物直接或构建克隆重组质粒后测序,以GenBank Blast软件分析序列.结果 宫颈癌组织标本中,HPV16检出率为72%（18/25）;检出10种HPV16 URR核苷酸突变模式,同源性在98.67%～99.69%之间;检出3个URR序列中的热突变位点,分别为G7520A（100.00%）、G7192T（100.00%）和T7713G（33.33%）.结论 宫颈癌组织中HPV16 URR存在多种基因突变类型和模式,可能与病毒致癌潜能及宫颈癌的发生相关.