保肾通络方对糖尿病肾病小鼠肾小管间质纤维化及上皮细胞间充质转分化的影响

目的:观察保肾通络方对糖尿病肾病(DN)小鼠肾小管间质纤维化及上皮细胞间充质转分化(EMT)的影响。方法:选用KK-Ay小鼠作为DN模型小鼠,随机分为模型组、保肾通络方组及缬沙坦组,正常对照组小鼠选用C57BL/6J小鼠。保肾通络方组小鼠给予保肾通络方灌胃治疗,缬沙坦组小鼠给予缬沙坦灌胃治疗,模型组、正常对照组小鼠给予剂量相同的蒸馏水灌胃治疗;灌胃给药12周后检测各组血清肌酐、尿素氮水平,HE、PAS、Masson染色观察肾组织病理改变,同时进行细胞外基质蛋白CollagenⅠ、FN及肾小管EMT标志蛋白α-SMA、E-cadherin表达检测。结果:模型组小鼠血清肌酐、尿素氮水平较正常对照组明显升高(均P<0.05),保肾通络方组及缬沙坦组小鼠血清肌酐、尿素氮水平较模型组明显降低(均P<0.05)。与正常对照组相比,模型组小鼠肾小管出现明显的间质纤维化及上皮细胞脱落、空泡变性,而保肾通络方组及缬沙坦组小鼠上述病理改变均明显减轻。模型组小鼠肾小管CollagenⅠ、FN蛋白及mRNA表达较正常对照组明显上调(均P<0.05),保肾通络方组及缬沙坦组小鼠肾小管CollagenⅠ、FN蛋白及mRNA表达较模型组明显下调(均P<0.05)。与正常对照组相比,模型组小鼠肾小管上皮细胞α-SMA蛋白及mRNA表达明显上调,E-cadherin蛋白及mRNA表达明显下调(均P<0.05);与模型组相比,保肾通络方组及缬沙坦组小鼠α-SMA蛋白及mRNA表达明显下调,E-cadherin蛋白及mRNA表达明显上调(均P<0.05)。结论:保肾通络方能够改善DN小鼠肾小管间质纤维化,减轻肾小管EMT。

内皮祖细胞与间充质干细胞治疗血管支架相关疾病

背景:随着干细胞研究的发展,成体干细胞如内皮祖细胞和间充质干细胞在动脉粥样硬化、血管支架植入损伤并发症中的治疗效能逐渐被发现,由于静脉输注成体干细胞治疗疾病存在靶向性差、治疗效率低等问题,近年来对血管支架表面改性以实现内皮祖细胞或间充质干细胞的局部聚集与功能调节一直是研究的焦点。目的:论述内皮祖细胞、间充质干细胞在血管支架相关疾病中的治疗进展,以及基于内皮祖细胞、间充质干细胞的血管支架设计方面的研究现状。方法:在CNKI、万方、PubMed、Web of Science数据库检索建库以来发表的相关文献。中文检索词“内皮损伤,支架植入术,血栓,内膜增生,动脉粥样硬化,内皮修复,内皮祖细胞,间充质干细胞,血管支架”;英文检索词“endothelial injury,stenting,thrombosis,intimal hyperplasia,atherosclerosis,endothelial repair,endothelial regeneration,endothelial progenitor cell,mesenchymal stem cell,vascular stent,vascular scaffold”。根据纳入和排除标准,最终对127篇文献进行综述。结果与结论:内皮祖细胞、间充质干细胞能够通过分化以及旁分泌作用治疗动脉粥样硬化及支架植入损伤并发症,其作用机制主要包括保护内皮细胞、调节炎症细胞与炎症因子表达、调节平滑肌细胞增殖和表型等。间充质干细胞在治疗应用中可能伴有血栓、血管钙化等不良反应,使用细胞外囊泡、联合使用肝素进行表面设计是解决这一问题的可行方案。目前基于内皮祖细胞的支架研究较多,主要从内皮祖细胞的募集、捕获、增殖、分化与活性等方面进行支架表面改性;血管领域基于间充质干细胞捕获的支架研究较少,但间充质干细胞来源外泌体洗脱支架被发现具有极高的治疗效能。此外一些基础疾病如糖尿病可能会对成体干细胞活性造成影响,导致基于干细胞设计的支架失去效能,因而未来在设计相应的支架时,应注意考虑这方面的影响因素。

内皮素-1活化ROCK/SLUG诱导人卵巢癌细胞发生上皮向间充质转分化

目的研究ROCK/SLUG信号通路在内皮素-1(endo-thelin-1,ET-1)促进人卵巢癌细胞上皮向间充质转分化(epi-thelial to mesenchymal transition,EMT)中的作用。方法 ET-1处理人卵巢癌细胞株SK-OV-3和CaOV3,或共用ROCK的活化突变体转染细胞或加入ROCK的抑制剂Y27632,并转染含SLUG启动子的pGL3质粒与Renilla质粒。实验末用Boyden小室体外侵袭实验检测细胞侵袭能力,细胞免疫荧光染色观察细胞形态,报告基因检测试剂盒检测SLUG启动子活性,用实时定量PCR和Western bot方法检测EMT相关基因的表达。结果 ET-1诱导SK-OV-3和CaOV3发生与EMT相一致的形态和基因变化,促进其细胞侵袭力;ET-1与内皮素A受体(endothelin A receptor,ETAR)结合,促进转录因子SLUG的转录;ET-1促进ROCK及fibronectin的表达,同时转染ROCK的活化突变体,促进ET-1诱导的fibronectin表达以及细胞侵袭力的增加。相反,ROCK抑制剂Y27632抑制ET-1对fibronectin表达以及细胞侵袭力的促进作用;转染ROCK的活化突变体,上调SLUG基因转录启动子活性促进其转录,抑制E-cadherin的转录。相反,ROCK的抑制剂Y27632抑制SLUG基因启动子的活性。结论 ET-1通过活化ROCK/SLUG通路促进人卵巢癌细胞发生EMT。

温肾通络止痛方对小鼠H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响

背景:骨骼依赖血管与骨细胞之间的密切连接来维持完整性,骨骼处在生理低氧环境中,因此在低氧环境下研究血管生成与骨生成具有重要意义。目的:探究在低氧环境下温肾通络止痛方对H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响及相关机制。方法:运用酶消化法及流式分选技术,分选小鼠H型血管特异型骨微血管内皮细胞;应用骨髓贴壁法分离获取小鼠骨髓间充质干细胞;采用Transwell小室以及缺氧培养工作站建立两种细胞低氧共培养体系,使用50,100μg/m L质量浓度温肾通络止痛方冻干粉进行干预;通过划痕迁移实验与管形成实验评估共培养体系内H型骨微血管内皮细胞的成血管功能;通过碱性磷酸酶染色与茜素红染色评估共培养体系内骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;使用Western Blotting与q-PCR检测共培养体系内H型骨微血管内皮细胞中PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白表达及mRNA表达。结果与结论:(1)与常氧组相比,低氧组H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度均显著升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强(P<0.05);PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达升高(P<0.05);(2)与低氧组相比,经不同质量浓度温肾通络止痛方干预后H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度进一步提高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强(P<0.05),PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达也进一步升高(P<0.05)。结果表明:低氧条件下H型血管生成及骨生成可能与PDGF/PI3K/AKT信号轴有关,而温肾通络止痛方可能通过激活PDGF/PI3K/AKT信号轴促进“H型血管生成-骨生成”作用从而防治骨质疏松症。

剪切力作用下巨噬细胞和间充质干细胞内皮向分化的相互作用

目的损伤血管会发生局部力学环境变化,巨噬细胞会大量浸润,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可归巢至局部参与早期再内皮化修复,本文主要研究剪切力作用下巨噬细胞和间充质干细胞内皮向分化的相互作用。方法采用transwell直接共培养巨噬细胞和MSCs,通过RT-PCR和免疫组化技术检测细胞表达内皮细胞相关因子基因和蛋白的情况,利用流式细胞术检测巨噬细胞的表型。使用脂多糖、干扰素-γ和白细胞介素4分别诱导获得高纯度M1、M2型巨噬细胞,提取其培养上清制备条件培养基,探究间接共培养下巨噬细胞对MSCs向内皮细胞方向分化的影响。利用实验室自制的细胞力学生物学实验系统加载剪切力,研究剪切力作用下巨噬细胞和间充质干细胞内皮向分化的相互作用。结果直接共培养下,巨噬细胞可以促进MSCs表达内皮细胞相关的基因和蛋白,同时,巨噬细胞自身向M2表型极化。间接共培养下,M1型和M2型巨噬细胞均可以促进MSCs内皮向分化,其中M2型巨噬细胞的促进效果更显著,与间接共培养作用的促进效果无显著差异。剪切力条件下,M2型巨噬细胞可以更好地促进MSCs向内皮细胞方向分化,尤其是较高剪切力组。结论剪切力可以影响巨噬细胞和间充质干细胞内皮向的相互作用,但其规律和机制有待进一步深入研究。

剪切力对骨髓间充质干细胞向角膜上皮细胞方向分化的影响

目的干细胞在角膜修复中起到了重要作用,在体外生化因素或共培养等可以诱导干细胞向角膜上皮细胞方向分化,力学因素可以影响干细胞的生物学功能,本文主要研究流体剪切力对兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells,RBMSCs)向角膜上皮细胞方向分化的影响。方法使用含有表皮生长因子、胰岛素、兔角膜上皮细胞培养上清液的条件培养基诱导RBMSCs向角膜上皮细胞方向分化;利用平行平板流动腔对诱导或者不诱导的RBMSCs加载5、10、15 dyn/cm^(2)流体剪切力;通过倒置相差显微镜和激光共聚焦显微镜观察剪切力对细胞形态和骨架的影响,通过RTPCR和免疫组化等检测剪切后细胞表达角膜上皮相关基因和蛋白的情况。结果剪切后的细胞表现出更加突出和伸长的肌动蛋白丝,且平行于剪切力方向排列。剪切力可以上调CK3、CK12和PAX6等角膜上皮细胞标志物的基因和蛋白表达,尤其是5 dyn/cm^(2)剪切力的作用更为显著。结论适当的剪切应力可以促进RBMSCs向角膜上皮细胞方向分化,但其机制还有待进一步的深入探究,以期为干细胞应用于角膜上皮损伤修复的治疗提供参考。

RNA干扰抑制Snail表达对A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭的影响

目的:研究用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制转录因子Snail表达后,对人肺腺癌A549细胞上皮-间充质转分化表型和体外侵袭能力的影响。方法:构建能表达针对Snail的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)的RNA干扰载体(Snail siRNA vector)和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNA干扰载体(control siRNA vector),分别转染A549细胞,新霉素抗性筛选得到Snail表达受抑制的A549-siSnail细胞和Snail表达未受影响的A549-siControl细胞。针对非转染(A549-nontransfection)、A549-siSnail、A549-siControl三组细胞,分别采用RT-PCR和Western blot技术检测Snail、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙粘素表达,用Boyden chamber模型检测细胞侵袭能力。结果:A549-nontransfection组:Snail和α-SMA表达强阳性,E-钙粘素表达弱阳性;A549-siSnail组:和A549-nontransfection组相比,Snail和α-SMA表达显著减弱(P<0.01),E-钙粘素表达显著增强(P<0.01),Boyden chamber穿膜细胞数显著减少(P<0.01);A549-siControl组:Snail、α-SMA和E-钙粘素表达,及Boyden chamber穿膜细胞数皆和A549-nontransfection组无显著差异(P>0.05)。结论:通过RNA干扰阻滞Snail表达能有效地抑制A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭能力。Snail可能在肺腺癌上皮-间充质转分化及侵袭过程中扮演重要角色,抑制Snail表达可能成肺腺癌治疗的可行策略。

血管内皮生长因子对肾小管上皮-间充质细胞转化的作用及其与骨形成蛋白-7、分化抑制因子表达的关系

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)对肾小管上皮-间充质细胞转化(EMT)的作用及其与骨形成蛋白-7(BMP-7)、分化抑制因子(Id)2、Id3表达的关系。方法体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)经转化生长因子-β1(TGF-β1,5ng/ml)与不同浓度VEGF165(0.1、1、10、100ng/ml)共同作用,或TGF-β1(5ng/ml)与血管内皮生长因子受体-1(VEGFR1)抗体(10μg/ml)共同作用48h后,免疫组织化学双染方法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素表达,实时荧光定量PCR法、Westernblot法检测细胞α-SMA、BMP-7、Id2和Id3的表达。TGF-β1(5ng/ml)、VEGF165(100ng/ml)与激活素受体样激酶-6/Fc嵌合体(Alk6/FcChimera)(2μg/ml,中和内源性BMP-7)共同作用48h后,Westernblot法检测细胞α-SMA、Id2的表达情况。结果TGF-β1作用后,α-SMA表达比正常对照显著增强(P<0.05),E-钙黏素、BMP-7、Id2及Id3的mRNA及蛋白质表达均显著减弱(P<0.05)。VEGF165以浓度依赖方式增强BMP-7及Id2蛋白表达,而显著降低TGF-β1上调α-SMA表达的作用(P<0.05)。加入VEGFR1抗体(10μg/ml)后,TGF-β1上调α-SMA表达的作用显著增强(P<0.05),而E-钙黏素、BMP-7、Id2表达显著减弱(P<0.05)。TGF-β1+VEGF165+Alk6/FcChimera共同作用后α-SMA蛋白表达比TGF-β1+VEGF165共同作用后显著增强(P<0.05),而Id2表达差异无显著性。结论VEGF165可抑制TGF-β1诱导HK-2细胞发生EMT;其机制可能与BMP-7和Id2表达上调有关,而与Id3表达变化无关。Id2表达增强可能与VEGF165的直接作用有关,而与BMP-7无关。

泽泻醇B抑制C3a介导的人肾小管上皮细胞间充质转分化的实验研究

目的探讨泽泻醇B能否抑制C3a介导的肾小管上皮细胞间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。方法将体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)分别用5ng/mL转化生长因子β(transfor-ming growth factor-β,TGF-β)、0.1μmolC3a和0.1μmolC3a加10μmol泽泻醇B进行干预。分别采用RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光法检测HK-2细胞C3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA及蛋白表达。结果经C3a刺激后,HK-2细胞C3mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.01),α-SMA mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.01),E-cadherin mRNA及蛋白表达明显减少(P<0.01)。与经外源性C3a干预组比较,经泽泻醇B干预后,HK-2细胞α-SMA mRNA及蛋白表达明显减少(P<0.01),E-cad-herin mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论外源性C3a能诱导肾小管上皮细胞发生EMT,泽泻醇B可抑制C3a诱导的EMT。

术后腹腔粘连形成机制及间充质干细胞外泌体的治疗前景

背景:术后腹腔粘连的形成是一个复杂的过程,预防术后粘连是临床上亟待解决的问题。目的:旨在从细胞及分子水平分析粘连的发生机制,为间充质干细胞外泌体预防和治疗粘连提供理论依据。方法:以“腹腔粘连,盆腔粘连,术后粘连,上皮间充质转化,间充质干细胞,干细胞外泌体,间充质干细胞外泌体”为中文检索词,以“Abdominal adhesion,pelvic adhesion,postoperative adhesion,epithelial mesenchymal transformation,mesenchymal stem cell,stem cell exosomes,mesenchymal stem cell exosomes”为英文检索词,检索PubMed、中国知网和中国生物医学文献数据库,筛选各数据库建库至2023年8月发表的术后腹腔粘连及间充质干细胞外泌体干预研究的相关文章,并进行系统的整理分析,最终纳入54篇文献进行综述。结果与结论:(1)任何腹膜炎症、机械损伤、组织缺血和异物植入等病理因素均可引起腹膜表面的损伤,引起术后腹腔粘连;腹腔粘连的形成过程包括腹膜间皮细胞修复、炎性反应、纤溶系统及凝血途径等过程的相互作用,涉及多种细胞因子及信号通路,包括Wnt/β-catenin通路能诱导纤维化和血管生成,并与转化生长因子β/Smads信号通路相互协同,能刺激成纤维细胞增殖,引起腹膜纤维化;同时,核转录因子kB信号通路上调细胞炎症因子的表达,促进成纤维细胞增生,组织纤维化的过程中发挥关键作用。(2)干细胞的旁分泌功能是目前以再生医学为基础的分子干预腹腔粘连的重要方向,可以参与作用于腹腔粘连中的多种复杂细胞因子及信号通路。(3)相对于传统治疗腹腔粘连的方法,间充质干细胞外泌体具有生物活性、使用安全、无需特殊培养和扩增、更低的免疫原性及较长的稳定性等优势,能通过多种途径引导一种正常的修复和愈合。(4)间充质干细胞外泌体在以往研究中均被证明可以参与调节粘连形成的上述各过程,在临床研究中显示出潜在的应用前景,但需要进一步临床研究以探索适当的间充质干细胞外泌体治疗方案,来解决临床转化的问题。

高糖及核因子κB通路诱导足细胞上皮间充质转分化的研究

目的:探讨高糖对小鼠足细胞上皮间充质转分化(EMT)与迁移的影响及其分子机制。方法:以永生化小鼠足细胞株(足细胞)为研究对象,设置正常糖组(5 mmol/L葡萄糖)、甘露醇组(5 mmol/L葡萄糖+25mmol/L甘露醇)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、核因子κB(NF-κB)特异性抑制剂小白菊内酯(PTL)+高糖组,作用时间24h。采用Transwell检测细胞迁移能力,Western Blot检测蛋白表达,q PCR检测mRNA表达情况,免疫荧光检测NF-κB入核情况。结果:与正常糖及甘露醇组比较,高糖刺激足细胞24h后细胞的迁移能力明显增强(P<0.05),足细胞特征性蛋白nephrin明显下调(P<0.05),纤连蛋白(FN)及mRNA表达显著增加(P<0.05),而E钙黏蛋白(E-cadherin)及其mRNA表达明显下降(P<0.05)。同时,与上述对照组比较,高糖明显上调p-IκBα(P<0.05)下调IκBα(P<0.05)促使足细胞胞质中的NF-κB入核同时上调p-p65的表达;干预细胞PTL后,足细胞的EMT和迁移得到明显抑制(P<0.05),nephrin蛋白表达明显上升(P<0.05)。结论:高糖通过激活NF-κB通路诱导足细胞发生EMT及迁移。

针对Twist的短发夹RNA抑制A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭

背景与目的:上皮-间充质转分化在胚胎发育和肿瘤转移过程中起重要作用。在发现人肺腺癌A549细胞高表达转录因子Tw ist的基础上,本实验研究了针对Tw ist的短发夹RNA(short hairp in RNA,shRNA)对体外培养的人肺腺癌A549细胞上皮-间充质转分化和体外侵袭能力的影响。方法:构建能表达针对Tw ist mRNA的shRNA的阳性RNA干扰(RNA i)质粒和表达不针对任何已知mRNA的shRNA的阴性RNA i质粒,分别转染至A549细胞,新霉素抗性筛选得到Tw ist表达受抑制的阳性RNA i细胞(P i组)和Tw ist表达未受影响的阴性RNA i细胞(N i组)。针对正常(C组)、P i、N i三组A549细胞,分别采用RT-PCR和W estern b lot技术检测Tw is、tα-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙粘素表达,用Boyden小室模型检测细胞体外侵袭能力。结果:C组:Tw ist和α-SMA表达强阳性,E钙-粘素表达弱阳性,Boyden小室穿膜细胞数为57.4±3.4;P i组:和C组相比,Tw ist和α-SMA表达显著减弱(P<0.01),E钙-粘素表达显著增强(P<0.01),Boyden小室穿膜细胞数显著减少(P<0.01);N i组:Tw is、tα-SMA和E-钙粘素表达,及Boyden小室穿膜细胞数皆和C组无显著差异(P>0.05)。结论:针对Tw ist的shRNA能有效地抑制A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭能力。

水蛭素对缺氧诱导心脏微血管内皮细胞间质转分化的作用及机制研究

目的探讨通络药物水蛭素对缺氧诱导的人心脏微血管内皮细胞(HCMECs)间质转分化(EndMT)的作用及可能机制。方法取常规培养的HCMECs细胞,随机分为对照组、缺氧组、水蛭素组(包括0、20、40、80、100μg/ml 5个浓度)。对照组常规培养不做任何处理,缺氧组置入低氧培养箱72 h,水蛭素组预加入Hirudin工作液,4 h后置入低氧培养箱72 h。MTS比色法检测HCMECs增殖能力;倒置显微镜观察HCMECs形态;免疫荧光鉴定HCMECs间质转分化情况,Western-blot检测内皮间质转分化相关蛋白:包括内皮细胞标记血小板—内皮细胞黏附分子(PECAM-1/CD31)、血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin),间质细胞标记α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP-1),以及低氧诱导因子1α(HIF-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad同源物2/3(Smad2/3)、锌指转录因子(snail)等相关信号通路的蛋白表达。结果MTS法检测显示,缺氧显著抑制细胞活性(P<0.01),水蛭素在20~100μg/ml浓度范围内可提高细胞活性,且呈现浓度依赖性,当浓度为100μg/ml时细胞活性最强(P<0.01)。各组细胞培养72 h后,倒置显微镜下观察发现:对照组细胞呈铺路石样或鹅卵石状结构,缺氧组细胞由鹅卵石状结构变为分散的长梭形,接近成纤维细胞形态,水蛭素组长梭形细胞形态明显改善,细胞恢复鹅卵石样。Western-blot与免疫荧光结果显示:与对照组比较,缺氧组CD31、VE-cadherin蛋白水平降低(P<0.01),且vWF表达减少,α-SMA、FSP-1蛋白水平升高(P<0.01),且vimentin表达增强;与缺氧组比较,水蛭素明显增加CD31、VE-cadherin蛋白表达(P<0.01),并增强vWF表达,下调α-SMA、FSP-1蛋白表达(P<0.01),并减弱vimentin表达;与对照组相比,缺氧组信号通路HIF-1α、TGF-β1、p-smad2/3、snail蛋白表达均升高(P<0.01),与缺氧组比较,水蛭素下调HIF-1α、TGF-β1、p-smad2/3、snail蛋白表达(P<0.01)。结论水蛭素可以改善缺氧诱导的HCMECs细胞发生EndMT,其机制可能与调控HIF-α/TGF-β1/smad/snail通路有关。

Klotho对FGF2诱导的肾小管上皮细胞上皮-间充质转分化的抑制作用

目的探讨Klotho抑制成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor2,FGF2)诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)上皮-间充质转分化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)的作用及机制。方法重组人Klotho蛋白预孵育前后,倒置显微镜观察FGF2对HK-2细胞形态的影响,免疫荧光检测上皮细胞标志物cytokeratin和间充质细胞标志物vimentin的表达变化,Western blot检测α-SMA、E-cadherin和ERK1/2的表达变化。结果 100 ng/mL的FGF2作用于HK-2细胞48 h后,HK-2细胞变成长梭形,细胞间隙明显增大,上皮细胞标志物E-cadherin的表达明显下降,间充质细胞标志物α-SMA表达明显升高(P<0.05),提示FGF2可以诱导HK-2细胞发生EMT。而Klotho蛋白预孵育可以显著抑制FGF2诱导的EMT,并且FGF2/FGFR(FGFs受体)下游信号分子pERK1/2的表达明显减弱(P<0.05)。结论 Klotho可以通过减弱FGF2信号通路活化抑制FGF2诱导的HK-2细胞EMT,Klotho可能参与了肾间质纤维化的发生和发展。

从上皮细胞-间充质细胞转分化视角探索化纤方系列验方与艾灸防治肺纤维化的生物学机制

上皮细胞-间充质细胞转分化是恶性肿瘤、器官纤维化及伤口愈合发生的基础,也是从生物学机制上认识中药验方与艾灸阻抑肺纤维化疗效机理的较佳视角;肺纤维化是国际医学界关注度极高的一重大病种,中药验方与艾灸在肺纤维化的防治上具有独特优势。世界著名科学杂志《自然》和国家自然科学基金委均引导医学科学界重视对上皮细胞-间质细胞转分化加强探索,国内西医界去年已启动该方面研究,而中医中药、针灸界至今却未行动。本文整合前期研究优势及工作基础,提出从上皮细胞-间质细胞转分化视角探索"化纤方"系列验方与艾灸防治肺纤维化效应机制的假说,以冀对未来中医进入这一研究焦点和热点奠定铺路石。

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景:骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议。目的:体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力。方法:分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化。另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周:单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10μg/L转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照。结果与结论:小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约 60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达。小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约 70%的细胞呈阳性,RT-PCR 显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和 CD34。提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力。

ILK介导TGF-β/Smad通路诱导肾小球内皮细胞-间充质细胞转分化的研究

目的观察TGF-β1在肾小球内皮细胞-间充质细胞转分化(EndMT)中的作用,探讨ILK介导TGF-β/Smad信号通路在EndMT过程中的作用。方法以体外培养人肾小球内皮细胞为研究对象,分为空白对照组、TGF-β1 12.5、25.0、50.0ng/mL组、TGF-β1 50.0ng/mL+Ⅰ型受体抑制剂(LY364749)5.0μmol/L组和ILK抑制剂(QLT-0267)5.0μmol/L组,各组细胞在上述处理因素下培养48、72h,以RT-PCR测定P-Smad2/3和ILK mRNA的表达水平,以Western blot测定P-Smad2/3、ILK及E-cadherin、CD31、α-SMA和FSP-1蛋白的表达水平。结果 (1)TGF-β1可剂量依赖性诱导HGEnCP-Smad2/3和ILK mRNA水平显著升高(P<0.01)以及P-Smad2/3、ILK、α-SMA和FSP-1蛋白水平显著升高(P<0.01),但是剂量依赖性诱导E-cadherin和CD31蛋白水平显著降低(P<0.01);(2)TGF-β1Ⅰ型受体抑制剂和ILK抑制剂可显著抑制TGF-β1诱导ILK mRNA水平的升高(P<0.01)以及ILK、α-SMA和FSP-1蛋白水平的升高(P<0.01),抑制E-cadherin和CD31蛋白水平的降低(P<0.01);(3)TGF-β1Ⅰ型受体抑制剂可显著抑制TGF-β1诱导P-Smad2/3 mRNA和蛋白水平的升高(P<0.01),但是ILK抑制剂对PSmad2/3mRNA和蛋白无显著影响(P>0.05)。结论 TGF-β1可促进肾小球内皮-间充质细胞转分化,ILK作为下游效应因子介导TGF-β/Smad信号通路参与了该过程,可能在肾脏纤维化过程中发挥重要作用。

抗坏血酸促进骨髓间充质干细胞的上皮转分化

背景:研究表明,抗坏血酸具有增强血管弹性、强化骨骼、抗氧化的作用。目的:通过体外细胞分子生物学实验,观察抗坏血酸对骨髓间充质干细胞上皮转分化的促进作用。方法:不同浓度(0,10,20,40μmol/L)抗坏血酸处理骨髓间充质干细胞,光镜下观察骨髓间充质干细胞形态变化,筛选出最适处理浓度和时间(40μmol/L抗坏血酸干预48 h),进一步Realtime PCR检测骨髓间充质干细胞上皮相关分子E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白及间质相关分子snail1、转化生长因子β的表达,Western blot检测骨髓间充质干细胞内干性相关分子Oct4,Nanog,Sox2的表达。结果与结论:(1)光镜下观察,抗坏血酸处理24 h,骨髓间充质干细胞的形态开始由长梭形逐渐向形态较圆润的上皮细胞转化。随着抗坏血酸浓度的上调,形态学变化越显著。抗坏血酸处理48 h,光镜下约有90%以上的细胞出现以上变化;(2)抗坏血酸可通过上调骨髓间充质干细胞上皮相关分子(N-钙黏蛋白,E-钙黏蛋白)并下调间质相关分子(snail1,转化生长因子β)的表达,促进骨髓间充质干细胞间质上皮转化;(3)抗坏血酸在促进骨髓间充质干细胞间质上皮转化的同时,骨髓间充质干细胞干性(Oct4,Sox2,Nanog表达)未发生明显变化。

Wnt-7a蛋白通过wnt/β-catenin通路抑制单侧输尿管梗阻小鼠肾脏上皮细胞-间充质细胞转分化

目的:观察Wnt-7a蛋白对单侧输尿管梗阻模型小鼠肾脏纤维化的拮抗作用及其可能机制。方法:雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、UUO模型组和Wnt-7a蛋白治疗组,术后7 d行Masson染色观察肾间质纤维化程度,免疫组化染色检测肾组织E-钙黏素、α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白的表达,免疫印迹法测定肾皮质中E-钙黏素、α-平滑肌肌动蛋白及β-连环蛋白(β-catenin)的蛋白质表达。结果:与模型组相比,治疗组肾组织间质纤维化相对面积显著减少,α-平滑肌肌动蛋白及波形蛋白的表达显著减少,E-钙黏素表达显著增多(P<0.05)。同时,治疗组肾组织中β-catenin表达较模型组显著减少(P<0.05)。结论:Wnt-7a蛋白可以抑制肾脏上皮细胞-间充质细胞转分化的发生而减轻肾脏纤维化,其可能是通过抑制经典的wnt/β-catenin通路。

中药抗肾小管上皮细胞间充质转分化的研究进展

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）是各种慢性肾脏疾病发展到终末期肾衰竭的共同途径,以细胞外基质（extracellular matrix,ECM）在肾间质的过度积聚与沉积,以及成纤维细胞的增生为特征,是多种细胞、生长因子、细胞因子,共同参与、相互作用，最终导致ECM合成增多，降解减少，过度沉积的结果。