四磨汤通过调控NF-κB信号通路改善重度脓毒症大鼠结肠上皮细胞屏障功能障碍炎症状态作用研究

目的:探讨四磨汤对重度脓毒症大鼠结肠上皮细胞屏障功能障碍炎症状态的改善作用以及其对核转录因子κB(NF-κB)信号的调控机制。方法:采用盲肠结扎穿孔术(CLP)构建大鼠重度脓毒症模型;实验分组为正常组、模型组、四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组,每组10只;试剂盒检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的含量;末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)缺口末端标记(TUNEL)染色检测各组大鼠结肠组织的细胞凋亡;免疫荧光检测结肠组织中高迁移率蛋白-1(HMGB1)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)的表达;免疫组化检测结肠中白细胞共同抗原(CD45)、闭合蛋白1(Claudin-1)和闭锁蛋白1(ZO-1)的表达;Western blot法检测结肠组织中NF-κB、磷酸化NF-κB65(NF-κB p65)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达。结果:四磨汤能明显下调重度脓毒症大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量;抑制结肠组织中的细胞凋亡,降低结肠组织中HMGB1和NLRP3的表达,上调结肠组织中CD45、ZO-1和Claudin-1的表达;抑制NF-κB p65和Bax的表达,升高Bcl-2的表达,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:四磨汤能明显抑制重度脓毒症大鼠结肠上皮细胞的炎症应激状态,缓解结肠组织的病理损伤,改善结肠黏膜的屏障功能,这可能与抑制NF-κB信号的磷酸化有关。

血小板活化因子引起肠上皮细胞屏障非凋亡依赖性的通透性增高

目的研究血小板活化因子(PAF)对肠上皮细胞屏障通透性的影响,并探讨其作用位点。方法体外培养Caco-2细胞建立肠上皮细胞屏障模型。不同浓度PAF(0,50,100,200 nmol/L)作用24 h,应用TEER和荧光黄透过量检测肠上皮细胞屏障通透性;应用Annexin V和Hoechst染色,用荧光显微镜和流式细胞仪检测肠上皮细胞凋亡情况;透射电镜下观察紧密连接。结果 Caco-2细胞培养21 d左右可形成类似人肠黏膜上皮细胞屏障结构,给予50 nmol/L PAF即可引起TEER的下降和荧光黄透过率的增加,PAF100 nmol/L组肠上皮屏障通透性增加达到高峰,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。实验并未发现PAF引起明显的细胞凋亡增加,但透射电镜下出现了紧密连接的断裂和细胞超微结构的破坏。结论 PAF可直接引起肠上皮细胞屏障通透性增加,该作用是凋亡非依赖性的,作用位点在旁细胞途径。

中度低温对肠上皮细胞屏障氧化应激损伤后分泌炎症因子的影响及其临床意义

目的:通过检测中度低温下肠上皮细胞屏障氧化应激损伤后炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达水平,阐明中度低温对其炎症因子表达的影响及其临床意义。方法:应用Caco-2细胞株建立体外肠上皮细胞屏障模型,分中度低温组、常温组、亚低温组3个组,肠上皮细胞屏障氧化应激损伤后,应用逆转录PCR和实时荧光定量PCR检测细胞内炎症因子mRNA的表达水平,ELISA法检测培养上清中炎症因子的表达水平。结果:肠上皮细胞屏障氧化应激损伤后,中度低温组细胞内炎症因子的mRNA和以及培养上清中炎症因子的质量浓度明显低于常温组和亚低温组。结论:肠上皮细胞屏障氧化应激损伤后,中度低温比常温、亚低温更能抑制炎症因子的分泌,具有重要的临床意义。

腺苷A3受体激活对肠上皮细胞屏障的调节作用及其机制

目的探讨腺苷A3受体(A3AR)激活对体外肠上皮细胞屏障的作用及其潜在机制。方法使用A3AR激动剂2-Cl-IB-MECA处理TNF-α诱导的Caco-2细胞损伤模型。采用跨上皮细胞电阻值(TEER)法和细胞旁通透性测定法评估体外培养的上皮细胞屏障功能。采用免疫荧光法和蛋白质印迹法评估紧密连接蛋白ZO-1的分布和表达。采用蛋白质印迹法检测NF-κB p65、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)的表达水平。采用ELISA法检测细胞培养上清液中促炎细胞因子IL-1β、IL-8的表达水平。结果与对照组相比,TNF-α组TEER降低,细胞旁通透性增高,ZO-1表达水平降低,NF-κB p65、MLCK、p-MLC、IL-1β和IL-8的表达水平均升高,两组的差异均有统计学意义(P均<0.05)。与TNF-α组相比,2-Cl-IB-MECA组TEER升高,细胞旁通透性降低,ZO-1表达水平升高,NF-κB p65、MLCK、p-MLC、IL-1β和IL-8的表达水平均降低,两组的差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论A3AR激活可减轻肠上皮细胞屏障损伤,该作用可能通过抑制NF-κB/MLCK/p-MLC信号通路实现。

绿原酸通过TLR4/NF-κB信号通路调控脓毒症大鼠肠上皮细胞屏障功能的研究

目的 观察绿原酸通过调控TLR4/NF-κB信号通路减轻脓毒症(sepsis)大鼠肠道氧化应激损伤、改善肠上皮细胞屏障功能的作用。方法 选取SD大鼠60只,采用随机数字表法分成假手术组、模型对照组、绿原酸(低、高剂量)组,每组15只。术后24 h,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-10;比色法测定小肠组织中一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;采用Western blotting法测定小肠组织中的蛋白表达[密封蛋白-1(Claudin-1)、闭锁连接蛋白-1(ZO-1)及TLR-4/NF-κB通路相关的蛋白]。结果 与模型对照组[(4.45±0.14)分]比较,低剂量组[(4.17±0.22)分]、高剂量组[(1.95±0.08)分]Chiu评分明显下降(t=4.159、60.048,均P<0.001);高剂量组血清TNF-α、IL-6、IL-10水平及小肠组织中NO、MDA含量均显著降低(均P<0.05),SOD含量、Claudin-1、ZO-1蛋白表达量及MyD88、TLR-4蛋白与p-NF-κB p65(Ser536)水平均显著升高(均P<0.05)。结论 绿原酸可经抑制TLR4/NF-kB信号转导途径,减轻脓毒症大鼠的炎症反应程度及小肠组织的氧化应激损伤,进而促进大鼠的肠道屏障功能改善。

IL-1β对肠上皮细胞屏障通透性的影响

目的炎症性肠病是儿童和青少年时期重要的慢性胃肠道疾病，肠黏膜屏障的损伤在其发病中起重要作用。本研究通过IL-1β刺激Caco-2细胞单层，体外模拟炎症性肠上皮细胞屏障，为研究炎症性肠病的发病及治疗提供基础。方法体外培养Caco-2细胞21d模拟肠上皮细胞单层屏障。炎症1组从培养第5天开始每隔1天应用IL-1β处理2h检测TEER值，至第2l天。炎症2组于培养第18天换用含IL-1β培养液，分别于处理0、12、24、48、72h检测TEER。正常对照组用普通培养液培养，也于相应时间点检测TEER。结果正常对照组细胞TEER从第5天至第15天逐渐增加，在第15天达到600Ω·cm^2，并到达平台期保持至第21d。炎症1组细胞TEER值均低于正常组细胞，并且直至第21天仍〈500Ω·cm^2。炎症2组细胞显示时间依赖性的TEER逐渐降低，在48h达到最大值，然后在72h轻度回升。结论培养2～3周的Caco-2细胞能够形成具有极性的肠上皮细胞单层，对其给予IL-1β刺激可在体外模拟炎症性肠上皮细胞屏障。

Toll样受体2对肠上皮细胞屏障通透性的保护作用及机制

目的肠上皮细胞屏障的损伤与多种胃肠道疾病的发生密切相关，有效维持屏障功能是治疗这些疾病的关键。本研究试图通过体外实验探讨Toll样受体2（toll—like receptor，TLR2）对肠上皮细胞屏障通透性的保护作用及其机制。方法正常组将未转染Caco-2细胞，TLR2基因沉默Caco-2细胞，TLR2基因过表达Caco-2细胞培养21d形成单层，检测跨膜电阻（transepithelial electrical resistance,TEER）值，其反应上皮细胞屏障的通透性。炎症组3类细胞分别于培养第19d给予10ng／ml IL-1β刺激48h，于第21d检测TEER值。抑制剂组3类细胞分别在1L-1β前再给予PI3K／Akt通路抑制剂处理1h，于第21d检测TEER值。结果TLR2基因沉默能够显著减低Caco-2细胞单层的TEER值（P〈0．01），而TLR2基因过表达能够升高TEER值，但不具有统计学意义。TLR2能够防止IL-1β造成的TEER值下降（P〈0．01），此作用在给予PI3K／Akt通路抑制剂后消失。结论TLR2对肠上皮细胞屏障通透性具有调节作用，并且能够防止炎症造成的通透性增高，这种保护作用由PI3K／Akt通路参与介导。

S1P信号通路:上皮细胞和内皮细胞屏障功能调控的新靶点

1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一种具有多种生物活性的鞘脂类代谢产物,通过激活G蛋白偶联受体S1PRs调节重要的生理功能。S1P是维持上皮细胞和内皮细胞屏障功能重要的信号分子,S1P信号通路通过调节黏附连接和紧密连接组装、细胞骨架重排、黏着斑形成,发挥对屏障功能的调控作用,因此S1P信号通路可能成为改善急性肺损伤、炎症性肠病和败血症等疾病中屏障功能紊乱的新靶点。本文对S1P信号通路在上皮细胞和内皮细胞屏障功能调控中的作用及其在屏障功能破坏相关性疾病模型中的保护作用的研究进展进行综述,以期为开发治疗屏障功能破坏相关性疾病的新药提供理论参考。

CAR siRNA对睾丸支持细胞上皮屏障通透性的影响及机制

目的观察柯萨奇病毒—腺病毒受体(CAR)siRNA对睾丸支持细胞上皮屏障通透性的影响,并探讨其机制。方法采用睾丸支持细胞原代双室培养方法制备睾丸支持细胞上皮屏障,细胞培养3 d后分为CAR siRNA组、对照组,分别转染CAR siRNA、无同源性非靶向双链RNA。转染后第2天,分别采用RT-PCR和Western blotting法检测睾丸支持细胞中CAR mRNA、蛋白表达;采用Millicell-ERS电阻系统测量双室模型内外室的电位差;采用免疫荧光细胞化学染色法检测支持细胞的Occludin蛋白,荧光显微镜下观察Occludin分布情况;采用Western blotting法检测支持细胞中总Occludin蛋白量、与早期内涵体抗原1(EEA1)抗体结合的Occludin蛋白。结果 CAR siRNA组与对照组CAR mRNA相对表达量分别为0.122±0.013、0.429±0.039,CAR蛋白相对表达量分别为0.142±0.041、0.532±0.022,两组比较,P均<0.05。CAR siRNA组与对照组TER分别为(37±2.5)、(50±3.0)ohm·cm2,两组比较,P<0.05。CAR siRNA组与对照组Occludin蛋白相对表达量分别为0.164±0.025、0.143±0.031,两组比较,P>0.05。对照组Occludin呈蜂巢样沿细胞膜线状分布;CAR siRNA组Occludin分布较紊乱,细胞膜处减少,线性分布破坏,细胞质内增多。CAR siRNA组、对照组细胞中与EEA1结合的Occludin蛋白量分别为1.332±0.018、1.000±0.015,两组比较,P<0.05。结论 CAR siRNA能增加睾丸支持细胞上皮屏障通透性,其机制可能与其诱导Occludin蛋白内吞增强而分布改变有关。

干扰S100A4在屋尘螨诱导的哮喘气道上皮屏障功能的作用

目的:探讨干扰16HBE细胞中S100A4基因表达后,HDM(屋尘螨)诱导的气道上皮屏障功能和信号蛋白的变化。方法:合成靶向S100A4基因的siRNA,采用脂质体转染正常16HBE细胞,PCR和Western blot检测干扰效果,并使用HDM刺激正常和干扰后的16HBE细胞,检测跨细胞电阻、FITC通透性,以及屏障蛋白(E-cadherin、β-catenin)、下游信号分子VEGFR2/p-VEGFR2表达的变化。结果:siRNA干扰后成功抑制16HBE细胞的S100A4基因和蛋白表达。HDM引起正常16HBE细胞TEER减少和FITC通透性增加,干扰S100A4可抑制HDM对跨细胞电阻和FITC通透性的损害。HDM刺激导致E-cadherin、β-catenin表达下调,干扰S100A4可减轻HDM对16HBE细胞屏障蛋白的破坏。HDM刺激后引起培养液中S100A4释放增加,细胞p-VEGFR2表达显著增加,而siRNA干扰后的16HBE细胞p-VEGFR2的表达仅轻度增加。结论:S100A4在HDM诱导的气道上皮细胞屏障损害中具有重要作用,可为哮喘的防治提供重要科学依据。

肠道病原性大肠杆菌和宿主细胞间的相互作用

肠道病原性大肠杆菌(EPEC)属于胞外菌,主要通过粘附在肠上皮细胞上引起宿主的发病。EPEC形成基座、产生粘附和脱落(A/E)损伤的细菌因子、导致宿主信号转导改变的途径及其发病机制的遗传基础都已经得到广泛的研究。对近年来关于EPEC和宿主细胞间的相互作用的研究进展进行总结,并着重论述EPEC对于肠上皮细胞紧密连接的影响。

短链脂肪酸在疾病治疗中的研究进展

肠道内短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)浓度很高.他们是微生物自身以及宿主肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IESs)的能量来源,促进细胞生长,降低结肠内环境pH值,减少有害菌生长.近年研究证实,SCFAs能够调节宿主肠道免疫力,降低结肠炎症反应;抑制结肠肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和凋亡、影响原癌基因表达.本综述将详述SCFAs通过G蛋白偶联受体激活途径和组蛋白去乙酰化酶抑制途径,引起中性粒细胞和调节性T细胞应答,降低结肠炎;增强IESs屏障功能;抑制结肠肿瘤增殖;治疗非酒精性脂肪性肝病和肥胖.

非甾体抗炎药相关大鼠小肠上皮屏障损伤发生机制及其药物干预效果

目的：探讨 NSAID 相关大鼠小肠上皮屏障损伤的评价方法及机制，并研究黏膜保护剂和抑酸剂对上皮屏障的保护作用。方法将96只大鼠分成形态学观察组和机制研究组，每组48只。每组再分成8个亚组，分别为健康对照组、模型组（采用吲哚美辛造模）、替普瑞酮预防组、雷贝拉唑预防组、治疗对照组、替普瑞酮治疗组、雷贝拉唑治疗组，以及替普瑞酮、雷贝拉唑联合治疗组（简称联合治疗组），每个亚组6只。应用共聚焦激光显微内镜在体检测各亚组大鼠小肠脱落细胞间隙密度。采用ELISA 法检测各亚组大鼠血清 TNF-α水平，采用 Western 印迹法检测各亚组空肠组织 caspase-3， NF-κB，闭锁小带蛋白1和闭合蛋白水平。统计学处理采用 LSD-t 检验或 Hamhane′s T2检验。结果替普瑞酮预防组和雷贝拉唑预防组大鼠空肠组织的脱落细胞间隙密度分别为（57．43±24．55）/1000和（59．80±21．14）/1000，均低于模型组的（110．93±50．58）/1000，差异均有统计学意义（t ＝53．50、54．13，P 均＜0．01）。联合治疗组的脱落细胞间隙密度为（40．53±15．39）/1000，低于治疗对照组的（93．80±40．65）/1000，差异有统计学意义（t ＝44．27，P ＜0．01）。替普瑞酮预防组和雷贝拉唑预防组的血清 TNF-α水平分别为（25．80±8．97）和（22．74±7．15）ng/L，均低于模型组的（44．48±7．42）ng/L，差异均有统计学意义（t＝18．68、21．74，P 均＜0．01）。联合治疗组 TNF-α水平为（13．66±4．98）ng/L，低于治疗对照组的（24．67±6．70）ng/L，差异有统计学意义（t＝9．02，P ＜0．01）。替普瑞酮预防组和雷贝拉唑预防组的空肠组织 caspase-3水平分别为1．47±0．35和1．58±0．34，NF-κB 水平分别为1．27±0．14和1．21±0．10，与模型组（2．44±0．45和1．69±0．13）相比，差异均有统计学意义（t ＝0．97、0．86、0．42、0．48，P 均＜0．01）。联合治疗组的 caspase-3和 NF-κB 水平分别为0．66±0．06和0．44±0．21，低于治疗对照组，差异均有统计学意义（t＝0．34、0．56，P 均＜0．01）。替普瑞酮预防组和雷贝拉唑预防组的闭合蛋白水平分别为0．69±0．16和0．74±0．11，闭锁小带蛋白1水平分别为0．81±0．08和0．84±0．12，与模型组（0．45±0．22和0．64±0．07）相比，差异均有统计学意义（t＝0．24、0．29、0．17、0．21，P 均＜0．01）。联合治疗组的闭合蛋白和闭锁小带蛋白1水平分别为2．50±0．46和1．76±0．18，高于治疗对照组，差异均有统计学意义（t＝1．50、0．76，P 均＜0．01）。结论脱落细胞间隙密度或可作为预测炎性反应程度、上皮屏障通透性，以及评价药物疗效的有价值的指标。替普瑞酮和雷贝拉唑对 NSAID 相关大鼠小肠损伤有较好的预防和治疗作用。

NGAL在炎症性肠病中的研究进展

炎症性肠病(IBD)是一种慢性复发性胃肠道炎症性疾病,包括克罗恩病和溃疡性结肠炎,其确切病因和发病机制至今未明确。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)在调节肠道免疫、维持肠上皮屏障、协调肠道菌群构成中发挥重要的作用。此外,NGAL有助于IBD的临床检验。本文就NGAL在IBD中的研究进展作一综述。

ETS-1在炎症性肠病及结肠炎相关性结直肠癌中的研究进展

ETS原癌基因1(ETS-1)是ETS转录因子家族的成员之一,在肿瘤和炎症等方面发挥重要作用。在炎症性肠病(IBD)和结肠炎相关性结直肠癌(CAC)中,ETS-1通过诱导炎症反应、破坏肠上皮细胞屏障和增强癌细胞侵袭性等加快疾病的进展。为探索IBD及CAC的发病机制及潜在治疗靶点,本文就ETS-1在IBD及CAC中的研究进展作一综述。