多种转移潜能不同的人前列腺癌细胞“上皮细胞间质转化态”特性鉴定及其意义

目的:对多种转移潜能不同的人前列腺癌细胞“上皮细胞间质转化态”(EMT)特性进行鉴定,并从粘附因素和细胞骨架蛋白角度分析其骨转移潜能获得的分子机制。方法:用W estern印迹法鉴定LNCaP及其亚细胞系C4、C4-2和ArCaP亚细胞系IF11、IA8,以及PC-3、Du145等细胞中上皮型钙粘素(E-cadherin)、神经型钙粘素(N-cadherin)和波形纤维蛋白(V im entin)的表达差异情况,并分析其在前列腺癌转移过程中的作用。结果:E-cad-herin在PC-3、LNCaP、C4、C4-2中表达较高,但在Du145、IF11、IA8中表达极低;而V im entin的表达情况恰恰与E-cadherin相反;N-cadherin在IF11、IA8细胞中呈现显著的高表达状态。结论:转移潜能不同的人前列腺癌细胞株之间存在EMT表型的表达差异,其中PC-3、LNCaP、C4、C4-2是未发生EMT改变的细胞,Du145、IF11、IA8却是EMT化的细胞。EMT表型差异蛋白在解释前列腺癌转移机制方面占据着重要地位。

缺氧诱导因子1α诱导人前列腺癌细胞上皮间质化改变的研究

目的:研究人前列腺癌细胞在缺氧诱导因子1α(HIF-1α)诱导下能否发生上皮细胞间质转化态(EMT)改变,进而致侵袭能力增强,并初步分析其分子机制。方法:应用RT-PCR技术检测LNCaP细胞及其亚细胞系C4、C4-2、C4-2B这4种EMT阴性的人前列腺癌细胞中波形蛋白(vimentin)mRNA表达情况,并凭此筛选出适合于进一步作转染诱导试验的细胞。用脂质体Lipofectamine2000包装重组真核表达载体pCDNA3.1(-)/HIF-1α和pCD-NA3.1(-)空质粒后,分别转染上步试验所挑选出的人前列腺癌细胞LNCaP,600μg/mLG418筛选抗性克隆。免疫荧光及Western印迹法鉴定HIF-1α表达,Western印迹法检测EMT标志蛋白——上皮型钙粘素(E-cadherin)和vimentin的表达,Transwell验证转染后LNCaP细胞侵袭能力的改变。结果:RT-PCR证实4种EMT阴性的细胞中,仅LNCaP表达有vimentin编码基因,适合作转染诱导试验。免疫荧光也观察到HIF-1α转染细胞胞质中荧光亮度较空质粒转染细胞和未转染细胞明显增强。Western印迹法证实HIF-1α转染细胞发生了EMT转化,其E-cad-herin表达缺失,而vimentin表达增加。同时,Transwell体外侵袭试验也发现,LNCaP/HIF1α细胞的体外侵袭能力显著高于LNCaP细胞和LNCaP/pCDNA3.1(-)细胞。结论:HIF-1α过表达可以通过调节两种EMT相关蛋白诱导人前列腺癌细胞LNCaP发生EMT改变并致其侵袭能力增强。

β-连环蛋白信号通路介导缺氧诱导因子1α诱导人前列腺癌细胞的上皮细胞间质转化

目的明确β-连环蛋白（catenin）信号通路是否参与缺氧诱导因子（HIF）-1α诱导人前列腺癌细胞发生上皮细胞间质转化态（EMT）转化过程。方法应用Western印迹法检测HIF-1α、Glut-1和VEGF蛋白表达，确认2种新构建前列腺癌细胞株（LNCaP／HIF1α和PC-3／HIF1α）的稳定性；然后应用Western印迹法检测EMT指标蛋白（E—cadherin、CK18、Vimentin、N-cadherin及Fibronetin）的表达，对5种人前列腺癌细胞株（LNCaP、LNCaP／HIF1α、PC-3、PC-3／HIF1α和IA8）的EMT特性进行鉴定；进一步应用Transwell和MTT技术检测5种细胞株的体外侵袭和增殖潜能；最后，用RT-PCR和Western印迹法检测5种EMT特性不同的细胞株中β—catenin、tGSK-3β和pGSK-3β的表达，总结分析该信号通路活性与细胞EMT特性的关联。结果（1）LNCaP／HIF1α和PC-3／HIF1α中出现明显的HIF-1α蛋白条带，同时Glut-1和VEGF表达呈强阳性；（2）PC-3、LNCaP和PC-3／HIF1α是EMT阴性细胞，而LNCaP／HIF1α和IA8是EMT阳性细胞；（3）PC-3／HIF1α和LNCaP／HIF1α、IA8体现出了较PC-3和LNCaP更为强大的体外侵袭和增殖潜能；（4）与LNCaP和PC-3相比，PC-3／HIF1α和LNCaP/HIF1α、IA8中tGSK-3β和pGSK-3β的蛋白表达相对减少，但P—GSK3β／t-GSK3β比值相应较高，同时，β—catenin蛋白表达在LNCaP／HIF1α和IA8中相对较高，PC-3／HIF1α却表达较低；基因检测结果与前述蛋白表达规律基本一致，但是与β-catenin蛋白在PC-3／HIF1α中低表达不吻合的是，PC-3／HIF1α中β—cateninmRNA水平与其在LNCaP／HIF1α和IA8中一样呈现出强表达特点。结论β-catenin信号通路的活性状态与细胞EMT特性及其体外侵袭和增殖潜能有密切关系，该信号通路可能是介导HIF-1α诱导人前列腺癌细胞EMT过程的重要“桥梁”。

缺氧诱导因子1α诱导人前列腺肿瘤干细胞发生上皮细胞间质转化的实验观察

目的探讨前列腺癌上皮细胞间质转化现象（EMT）是否在肿瘤干细胞（CSC）水平发生。方法（1）将脂质体2000系统将缺氧诱导因子1仅（HIF一1d）cDNA分别转染人前列腺癌细胞株LNCaP中的干细胞亚群LNCaP／SP和非干细胞亚群LNCaP／NSP，G418筛选稳定表达HIF-1a的抗性克隆。（2）采用Western印迹法鉴定HIF-1a及两种受其调控的下游基因的蛋白表达。同时检测细胞转染前后EMT指标蛋白的表达变化。（3）应用Transwell和四甲基偶氮唑盐（MTI＂）技术验证两种转染后细胞的体外侵袭和增殖能力的变化。（4）将两种转染后细胞裸鼠皮下致瘤，观察致瘤率、转移率及瘤体体积的差异。结果Western印迹法证实，与LNCaP／SP相比，LNCaWHIF-1a／SP发生了典型的EMT：上皮型钙黏蛋白（E．cadherin）和细胞角蛋白18（CKl8）表达缺失，同时波形纤维蛋白（vimentin）、神经型钙黏蛋白（N—cadhefin）、纤维连接蛋白（fibronectin）、组织蛋白酶D（cathepsinD）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）和尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）反常表达；另外，与LNCaP／NSP相比，LNCaP／HIF．1a／NSP发生了部分EMT转化（CKl8表达缺失，同时vimentin和cathepsinD反常表达）。与LNCaP／HIF-1a／NSP相比，LNCaP／HIF．1a/sP的体外增殖和侵袭能力更强大。LNCaWHIF-1w／sP不仅在裸鼠体内的皮下致瘤率（80％比53％，P〈0．05）和骨转移率（40％比0，P〈0.01）显著高于LNCaWHIF-1a／NSP，而且瘤体体积也远大于LNCaP／HIF-1cJNSP的成瘤体积[（1008±230）mm^3与（288±145）mm3，P〈0．01]。结论CSC是人前列腺癌中EMT现象发生的主要细胞载体。

Wnt／β-catenin信号通路在多种人前列腺癌细胞系中的表达研究及意义

目的:检测多种不同上皮细胞间质转化(EMT)特性的人前列腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的表达,对细胞中Wnt/β-catenin信号通路的功能状态进行鉴定,分析其在前列腺癌EMT现象中可能的作用。方法:用Western印迹法鉴定LNCaP及其亚细胞系C4、C4-2、C4-2B和ARCaP亚细胞系IF11、IA8,以及PC-3、DU145细胞中β-连环素(β-catenin),糖原合成酶3β(t-GSK3β),磷酸化糖原合成酶3β(p-GSK3β)的表达差异情况。结果:β-catenin和p-GSK3β在LNCaP、C4、C4-2、C4-2B、IF11、IA8中表达较高,在PC-3中表达较低,在DU145中表达缺失,t-GSK3β在上述所有细胞中表达无明显差异。p-GSK3β/t-GSK3β比值在LNCaP、C4、C4-2、C4-2B、IF11、IA8中较高,在PC-3和DU145中较低。结论:8种不同EMT特性的前列腺癌细胞系中,Wnt/β-catenin信号通路的功能状态存在差异。

粘附分子E-钙粘素/β-连环素在LNCaP和ARCaP亚细胞系中的差异性表达及意义

目的:检测粘附分子E-钙粘素/β-连环素(E-cadherin/β-catenin)复合体在LNCaP和ARCaP亚细胞系IF11、IA8中的差异性表达,以探讨E-cadherin/β-catenin复合体与前列腺癌转移侵袭的关系。方法:用Western印迹及免疫荧光鉴定LNCaP和ARCaP亚细胞系IF11、IA8中E-cadherin、β-catenin的表达以及分布情况。结果:Western印迹显示E-cadherin在LNCaP细胞系中表达较高,在IF11、IA8中表达缺失,β-catenin在IF11、IA8中表达显著高于LNCaP(P<0.01)。免疫荧光显示β-catenin在LNCaP细胞系中主要分布在细胞膜上,而在ARCaP亚细胞系IF11、IA8中,主要分布于细胞核中;E-cadherin在LNCaP细胞中主要分布在细胞膜上。结论:不同上皮细胞间质转化态(EMT)特性的前列腺癌细胞系中E-cadherin/β-catenin表达以及分布存在差异,β-catenin的核转位可能是诱发前列腺癌细胞系发生EMT改变的机制之一。

针对人β-catenin基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建针对人β-catenin基因mRNA的shRNA真核表达载体,并转染HEK-293细胞,观察其对β-catenin的抑制效应。方法:化学合成用于产生针对β-catenin shRNA的对应DNA片段,将合成的寡核苷酸链退火形成双链,克隆入pSU-PER真核表达载体,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定,筛选阳性克隆。通过脂质体介导,把重组质粒转染HEK-293细胞,RT-PCR、蛋白质印迹法检测其对β-catenin mRNA和蛋白的干涉效果,MTT比色法检测β-catenin基因表达抑制的细胞和对照组细胞的增殖。结果:RT-PCR和蛋白质印迹法检测结果显示转染组β-catenin基因的表达水平下调,MTT检测显示β-catenin表达抑制的细胞光密度值下降,细胞增殖受到了抑制(P<0.01)。结论:成功构建了针对人β-catenin基因的shRNA载体,转染HEK-293细胞后可抑制β-catenin基因的表达。

EMT标记蛋白在胰腺癌组织中的表达和意义

目的探索EMT相关蛋白E-cadherin,Vimentin,α-SMA在胰腺癌组织中的表达情况。方法采用免疫组织化学方法检测46例胰腺癌患者手术切除的正常胰腺组织和胰腺癌组织中的E-cadherin,Vimen-tin,α-SMA的表达情况,并对不同病理分级和临床分期的标本作对比分析。结果胰腺癌与正常组织之间E-cadherin阳性表达率有显著性差异(P<0.05),正常组织显著高于胰腺癌组织;胰腺癌与正常组织之间Vim-entin,a-SMA阳性表达率有显著性差异(P<0.05),胰腺癌组织显著高于正常组织。三种蛋白的表达与胰腺癌的组织分化程度、临床分期密切相关(P<0.05)。结论 EMT现象是人体内胰腺腺癌恶性进展的重要原因。这种细胞属性的变化现象与肿瘤的侵袭和预后密切相关。

金龙胶囊对胃癌细胞MGC-803和BGC-823侵袭转移能力的影响

目的：探讨金龙胶囊对人胃癌MGC-803,BGC-823细胞侵袭和迁移能力的影响并对其具体机制进行探讨。方法：体外培养胃癌MGC-803,BGC-823细胞,分为金龙胶囊组（0.1,0.2,0.4,0.8 g·L-1）,空白组和5-氟尿嘧啶（5-FU）组,采用噻唑蓝（MTT）比色法分别检测金龙胶囊对MGC-803,BGC-823细胞增殖的抑制作用,计算半数抑制率（IC50）;采用细胞侵袭（transwell）小室法和划痕实验检测金龙胶囊处理MGC-803和BGC-823细胞24 h后,细胞侵袭和迁移能力发生改变;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测金龙胶囊处理MGC-803,BGC-823细胞24 h后E-钙黏素（E-cadherin）,基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表达情况。结果：金龙胶囊能明显抑制MGC-803,BGC-823细胞的增殖,呈一定的浓度及时间依赖性;与空白组比较,金龙胶囊能明细减少MGC-803,BGC-823细胞的穿膜细胞数目,可明显影响2种胃癌细胞的侵袭与迁移能力,并呈明显浓度依赖性（P〈0.05）;金龙胶囊组的划痕距离较空白组明显降低,影响MGC-803,BGC-823细胞迁移,并呈浓度依赖性（P〈0.05）;与空白组比较,金龙胶囊组能够提高MGC-803和BGC-823细胞中E-cadherin蛋白表达,降低MMP-2,MMP-9蛋白表达水平,且呈一定的量效关系（P〈0.05）。结论：金龙胶囊能够抑制人胃癌MGC-803,BGC-823细胞的侵袭和迁移能力,其作用机制可能与上调E-cadherin表达,抑制MMP-2,MMP-9表达水平有关。本研究证实了金龙胶囊对胃癌MGC-803,BGC-823细胞抗侵袭转移的部分机制。

EMT标记蛋白在前列腺癌组织中的表达及其意义

目的通过检测EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、a-SMA在前列腺癌组织中的表达及其与病理分级、临床分期的关系,初步判断体内EMT现象与前列腺癌进展是否存在确切的关联。方法采用免疫组织化学方法检测35例正常前列腺组织和43例前列腺癌组织中的上皮标记蛋白E-cadherin与间质标记蛋白Vimentin和a-SMA的表达情况,并与病理分级和临床分期之间的关联作统计学分析。结果E-cadherin、Vimentin、a-SMA在前列腺癌组织中的表达率分别为48.8%,72.1%,36.5%。这些蛋白的表达与前列腺癌的分化程度,病理分期密切相关(P<0.05),E-cadherin与Vimentin、a-SMA蛋白表达负相关。结论EMT转化现象是人体内前列腺癌恶性进展的重要原因。这种细胞属性的变化现象与肿瘤的侵袭和预后密切相关。