激活Shh信号通路影响结肠癌细胞上皮间质表型转化的研究

目的阐释激活Shh信号通路对结肠癌上皮间质表型转化(EMT)的影响。方法常规培养结肠癌细胞株HT-29细胞,设立对照组(培养液中加入PBS)、实验组(即信号通路活化,培养液中加入重组Shh配体);采用Westen-blot检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达水平的变化;RT-PCR检测上皮间质转化标志物E-cadherin和Vimentin在mRNA水平的变化;行HE染色观察细胞形态变化的改变。结果 Westen-blot检测蛋白提示,结肠癌HT-29细胞中,Shh信号通路激活可促进Vimentin蛋白表达(P<0.05),抑制E-cadherin蛋白表达(P<0.05);RT-PCR检测:实验组中E-cadherin和Vimentin的mRNA表达量差异具有统计学意义(P<0.05),与对照组相比较,实验组的Vimentin的mRNA表达量显著升高(P<0.05),E-cadherin的表达量明显降低(P<0.05);HE细胞染色提示对照细胞呈梭形,细胞间更紧密地连接,并与信号通路阻断组细胞无显著差异,而实验组细胞呈椭圆形或圆形,连接疏松,部分细胞呈团簇集群样生长。结论 EMT在结肠癌转移过程中起着重要的作用,而Shh信号通路的激活可促进结肠癌细胞EMT的发生、发展。

胆管结扎诱导的肝纤维化大鼠肝脏上皮间质表型的变化

目的观察胆管结扎诱导肝纤维化大鼠肝细胞是否发生上皮间质表型变化。方法 24只Wistar大鼠分为假手术组和胆管结扎组,运用HE及Massion染色检测肝纤维化变化;免疫印迹方法检测大鼠肝脏中上皮标志E-钙蛋白、白蛋白和I型胶原、波形蛋白的表达;采用免疫荧光双染的方法检测成纤维细胞特异性蛋白(FSP-1)+波形蛋白;FSP-1+I型胶原;FSP-1+白蛋白;白蛋白+I型胶原等蛋白在细胞中的定位。结果胆管结扎组大鼠的ISHAK纤维化评分(4.42±1.16 vs 0.00±0.00,P=-0.000),METAVIR纤维化评分(3.42±0.67 vs 0.00±0.00,P=-0.000)及Massion染色中胶原含量(0.30±0.06 vs 0.11±0.07,P=-0.000)较假手术组明显增高。与假手术组相比,胆管结扎组中上皮标志白蛋白(0.53±0.63 vs 1.12±0.01,P=0.000)、E-钙蛋白(0.21±0.01 vs 0.44±0.01,P=0.000)明显减少,而I型胶原(8.21±0.12 vs 0.24±0.01,P=-0.000)、波形蛋白(3.14±0.01 vs 0.37±0.01,P=0.000)显著增高。胆管结扎组中共表达FSP-1+波形蛋白、FSP-1+I型胶原、FSP-1+白蛋白、白蛋白+I型胶原的细胞较假手术组明显增多。结论在胆管结扎组诱导的肝纤维化大鼠肝脏中上皮标记减少,间质标志增加,提示有部分上皮细胞可能发生了上皮间质表型转化。

肝癌患者循环肿瘤细胞表型与临床病理特征的相关性研究

目的探讨原发性肝癌及复发性肝癌患者外周血中不同表型循环肿瘤细胞(CTCs)与其临床病理特征的相关性及其临床应用价值。方法回顾性分析2016年11月至2018年8月陆军军医大学第一附属医院肝胆科收治的111例原发性肝癌患者及56例复发性肝癌患者的临床资料。所有患者采用Canpatrol CTCs分型检测系统检测外周血上皮-间质表型CTCs,比较原发性与复发性肝癌患者外周血中各表型CTCs阳性率差异;分析原发性及复发性肝癌患者各表型CTCs与其临床病理特征的相关性。结果根据上皮及间质标志物将CTCs分为上皮型、间质型及混合型三种表型。原发性肝癌患者外周血上皮型CTCs、混合型CTCs、间质型CTCs的阳性率分别为30. 63%(34/111)、86. 49%(96/111)、46. 85%(52/111);复发性肝癌患者外周血上皮型CTCs、混合型CTCs、间质型CTCs阳性率分别为46. 43%(26/56)、26. 79%(15/56)、85. 71%(48/56);原发性及复发性肝癌患者外周血中上皮型、混合型、间质型CTCs阳性率差异均有统计学意义(χ~2=4. 035、23. 406、59. 522,P <0. 05)。原发性肝癌患者的上皮型CTCs与门静脉癌栓及微血管癌栓均呈正相关(r=0. 309和0. 330,P <0. 05),与肝硬化程度呈负相关(r=-0. 466,P <0. 05);混合型CTCs与微血管癌栓及门静脉癌栓分别呈正相关和负相关(r=0. 236、-0. 383,P <0. 05);间质型CTCs与肿瘤大小、门静脉癌栓、微血管癌栓、及巴塞罗那分期呈正相关(r=0. 757、0. 210、0. 708、0. 401,P <0. 05),与肿瘤分化程度呈负相关(r=-0. 243,P <0. 05)。复发性肝癌患者的上皮型CTCs与AFP及肿瘤个数呈正相关(r=0. 620、0. 391,P <0. 05);间质型CTCs与肿瘤大小、肿瘤个数呈负相关(r=-0. 335、-0. 354,P <0. 05);混合型CTCs与肿瘤大小及AFP分别呈正相关和负相关(r=0. 643、-0. 349,P <0. 05)。结论肝癌患者CTCs不同表型的阳性率与其临床病理特征具有显著相关性,可作为预测肝癌术后复发和评估疗效的辅助指标。

Shh信号通路对结肠癌细胞EMT作用的研究

目的观察Shh信号通路活化及阻断后结肠癌细胞形态及上皮间质表型转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)相关标志物上皮型钙黏着蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达的改变,进一步探讨Shh信号通路对结肠癌细胞上皮间质表型转化(EMT)的作用。方法通过常规培养结肠癌细胞株HT-29,设为三组,分别是:培养液中加入PBS(对照组)、培养液中加入重组Shh配体(信号通路活化组)、培养液中加入Shh信号通路抑制剂KADD-cyclopamine(信号通路阻断组)。通过应用RT-PCR、Westen-blot试验来检测上皮间质转化标志物E-cadherin和Vimentin在m RNA水平及蛋白表达的变化。结果RT-PCR试验显示:与对照组相比较,活化组的Vimentin的m RNA表达量明显升高(P<0.05)、E-cadherin的表达量明显降低(P<0.05),信号活化组与阻断组之间的两种蛋白表达有差异且具有统计学意义(P<0.05);Westen-blot试验检测蛋白显示:激活Shh信号通路后,活化组结肠癌细胞E-cadherin蛋白表达减弱,蛋白vimentin表达增强,而阻断组结肠癌细胞E-cadherin蛋白表达增强,蛋白vimentin表达减弱,且两组相比较有统计学意义(P<0.05)。结论激活Shh信号通路能够使结肠癌细胞发生上皮间质转化,抑制其活化可以降低结肠癌细胞的转变作用,结肠癌的转移可能与EMT的发生密切相关。

TGF-β1对话Hedgehog-Gli1信号调控肾小管上皮细胞表型转化和胶原累积

该研究旨在探讨Hedgehog-Gli1（HH）信号在肾小管上皮细胞表型转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）和胶原累积中的作用及与TGF-β1信号的对话机制。该实验通过体外培养大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,以溶剂作为对照组,以1～50 ng/m L重组蛋白sonic hedgehog（Shh）或5 ng/m L TGF-β1作为诱导组,以加入或不加入HH信号特异性阻断剂环靶明（cyclopamine,Cyp）5μmol/L为干预组。细胞培养24 h,采用ELISA、q RT-PCR、免疫细胞荧光染色和Western blot等方法检测HH信号相关分子（Ptch1、Smo和Gli1）、TGF-β1、EMT相关分子（Rac1蛋白、肌成纤维细胞标志物α-SMA和上皮细胞标志物E-cadherin）、III型胶原m RNA或蛋白的表达。结果发现,外源性Shh上调Smo和Gli1表达,抑制Ptch1表达,继而激活HH信号;HH信号活化抑制肾小管上皮细胞E-cadherin的表达,上调α-SMA、III型胶原和TGF-β1的表达。环靶明干预后,Smo表达下调,进而抑制HH信号、EMT和胶原累积,并下调TGF-β1的表达。应用TGF-β1诱导小管上皮细胞EMT,同时也上调HH信号分子Smo和Gli1的表达,下调Ptch1的表达,提示TGF-β1可诱导HH信号活化。综上所述,HH信号和TGF-β1均参与了肾小管上皮细胞EMT和胶原累积过程。HH信号活化可促进TGF-β1的表达,同时TGF-β1能激活HH信号,推测TGF-β1与HH信号可能存在交叉对话以调控EMT和胶原累积。

Hh信号通路在慢性肝脏损伤修复中的作用

Hh信号通路最早是在果蝇体内发现的一条高度保守的信号通路，随着研究的深入，目前发现该信号通路在脊椎动物体内也相当重要，它能够调节胚胎时期组织、器官的形成以及多种成人组织损伤修复反应，其中也包括肝脏。

肝细胞癌患者不同表型循环肿瘤细胞与临床特征的关系

目的探讨肝细胞癌（HCC）患者外周血中不同表型循环肿瘤细胞（CTCs）与临床特征的相关性。方法回顾性分析2015年4月至2016年12月南方医科大学珠江医院肝胆二科收治的77例HCC及21例肝脏良性病患者资料。所有患者均采用CanPatrol^TM系统检测外周血上皮-间质表型CTCs。明确各表型CTCs特异性来源于肿瘤灶，进一步分析各表型CTCs与HCC临床特征的相关性。结果根据上皮及间质标志物，将CTCs分为上皮型、间质型及混合型三种表型。所有肝脏良性病患者外周血中均未检测到CTCs，而上皮型、混合型及间质型CTCs在HCC患者外周血的阳性率分别为37．7％（29／77）、74．0％（57／77）和50．6％（39／77）；各表型CTCs在HCC患者中的阳性率均显著高于肝脏良性病患者（P〈0．05）。进一步的分析显示，HCC患者上皮型CTCs与AFP、肿瘤个数及门脉癌栓相关（P〈0．05）；混合型CTCs与门脉癌栓、肿瘤分化程度及巴塞罗那分级相关（P〈0．05）；间质型CTCs与肿瘤大小、门脉癌栓、肿瘤分化程度及巴塞罗那分级相关（P〈0．05）。结论上皮、混合、间质型三种CTCs能从不同方面反映HCC患者的临床特征，可作为评估HCC患者病情的辅助指标。