TGF-β_2对晶状体上皮细胞增生和上皮间质转分化的实验研究

目的探讨转化生长因子β2(TGF-β2)对晶状体上皮细胞(LECs)增生和上皮间质转分化的影响。方法体外培养的人LECs株HLE-B3,加入不同质量浓度的TGF-β2进行处理,分别采用MTT法测定其对细胞增生的影响;采用PI细胞周期染色分析检测细胞周期的改变;应用Western blot及免疫荧光分别检测connexin43、fibronectin及integrinβ1等转分化相关蛋白表达的变化。结果经TGF-β2处理后的细胞增生受到抑制,呈TGF-β2质量浓度和时间依赖性;细胞周期中S期细胞的比例明显降低;connexin43表达随TGF-β2处理时间的增加而逐渐降低,fibronectin及integrinβ1的表达则随TGF-β2处理时间的增加而逐渐上升。结论TGF-β2抑制了LECs的增生,显著下调LECs connexin43的表达,促进了细胞外基质的过度沉积,对后发性白内障的防治具有一定的应用前景。

去甲斑蝥素对TGF-β_1诱导的人近端肾小管细胞上皮间质转分化以及转录因子Snail1表达的影响

目的:探讨去甲斑蝥素对体外人源性肾小管细胞株(HK-2)上皮间质转分化以及转录因子Snail1的影响。方法:常规培养HK-2细胞,分为对照组、TGF-β1组、去甲斑蝥素组(NCTD组)。对照组为无血清DMEM培养,TGF-β1组为TGF-β15ng/ml诱导,NCTD组为不同浓度NCTD(0.5、1.0、2.5μg/ml)与TGF-β1(5ng/ml)共同作用,各组作用时间48h。采用RT-PCR、Western blot分别检测α-SMA、E-cadherin与Snail1表达水平的变化。结果:与对照组相比,TGF-β1组α-SMA mRNA和蛋白表达上调(P<0.05),E-cadherin mRNA和蛋白表达下调(P<0.05);与TGF-β1组相比,NCTD干预组α-SMA mRNA和蛋白表达下调(P<0.05),而E-cadherin mRNA和蛋白表达上调(P<0.05),且均呈剂量依赖性。与对照组相比,TGF-β1组Snail1 mRNA和蛋白表达上调(P<0.05);与TGF-β1组比较,NCTD干预组Snail1 mRNA和蛋白表达下调(P<0.05),具有一定的剂量依赖关系。结论:去甲斑蝥素具有抑制肾小管上皮细胞EMT的作用,该作用可能与下调转录因子Snail1的表达有关。

地塞米松改善脂多糖诱导的足细胞上皮间质转分化

目的观察地塞米松(DEX)对足细胞nephrin、Akt磷酸化及成纤维细胞特异性蛋白-1(fibroblast-specific protein1,FSP1)、结蛋白(desmin)表达的影响,探讨DEX在足细胞上皮间质转分化的可能作用。方法体外培养小鼠永生化足细胞,分别给予LPS或DEX干预,Annexin V-FITC/PI标记流式细胞测定足细胞的凋亡百分率,噻唑蓝(MTT)法测定足细胞活力,Western blot分别检测足细胞nephrin、Akt磷酸化水平,FSP1和desmin蛋白的表达。结果 LPS诱导足细胞凋亡,降低足细胞活力,减少nephrin、Akt的磷酸化,上调FSP1、desmin的表达;而DEX明显减少足细胞的凋亡,增加足细胞的活力,上调nephrin、Akt的磷酸化水平,降低FSP1、desmin的表达。结论地塞米松拮抗LPS引起的足细胞凋亡和失活,增加nephrin、Akt磷酸化水平,抑制足细胞上皮间质转分化而对足细胞有保护作用。

趋化因子受体CXCR7协同CXCR4调控胰腺癌趋向性转移及上皮间质转分化

目的探究CXCL12/CXCR4/CXCR7生物轴在胰腺癌细胞侵袭转移及上皮间质转分化(EMT)中的调控作用及其作用机制,为胰腺癌转移的治疗研究提供新依据。方法利用CXCR4 shRNA及CXCR7 shRNA分别构建低表达CXCR4和CXCR7的胰腺癌细胞株。通过细胞侵袭和细胞迁移实验,观察CXCR4、CXCR7对CXCL12诱导的胰腺癌细胞侵袭转移的影响;Transwell侵袭实验及Western blot法检测间接共培养条件下胰腺癌细胞MiaPaCa-2的侵袭能力及EMT指标E-cadherin、Vimentin的变化。结果 CXCL12/CXCR4/CXCR7生物轴能够调控胰腺癌细胞的侵袭转移。CXCL12能显著增强胰腺癌细胞的侵袭转移能力,与单独沉默CXCR4或CXCR7相比,同时抑制CXCR4和CXCR7可以显著抑制CXCL12的促胰腺癌细胞侵袭转移作用。结论 CXCL12/CXCR4/CXCR7生物轴能够调控胰腺癌细胞侵袭转移及EMT发生。

炎性相关刺激因子诱导乳腺癌上皮间质转分化的机制

目的乳腺癌的高转移率是威胁患者预后的主要因素。文中探讨炎性相关刺激因子肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)诱导乳腺癌细胞MCF-7发生上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的分子机制,为预防乳腺癌转移提供新思路。方法检测乳腺癌细胞MCF-7在TNF-α和过氧化氢(H2O2)作用下侵袭能力发生的改变。根据不同的处理方法将细胞分成对照组、TNF组、H2O2组、TNF+氮-乙酰半胱氨酸(N-acety-L-cysteine,NAC)组、H2O2+阿司匹林组和TNF+阿司匹林组。用RT-PCR以及Western blot方法,检测EMT相关因子Snail和上皮细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)在不同处理下的活性变化。结果TNF-α可促进MCF-7细胞发生EMT。在MCF-7细胞中,TNF-α可通过核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)依赖通路增加转录因子Snail的表达上调,促进细胞发生EMT。而ROS引起的E-钙黏蛋白减少以及细胞发生的EMT,仅被NF-κB抑制剂轻度抑制。结论炎性相关刺激因子TNF-α和ROS在诱导EMT时存在不同机制,TNF-α在促进肿瘤细胞发生转移中是通过NF-κB的作用上调转录因子Snail,进而降低E-钙黏蛋白的表达实现。ROS在促进细胞转移时NF-κB仅有次要作用。

转化生长因子-β2诱导的上皮间质转分化对人晶状体上皮细胞基因表型的影响

目的观察转化生长因子-β2(TGF-β2)诱导人晶状体上皮细胞(LECs)发生上皮间质转分化(EMT)时,其形态和基因表型所发生的变化。方法在体外培养的人LECs中,加入100 pg/mL浓度的TGF-β2,诱导其发生EMT,处理0、6、24、48 h后,观察其在形态上的变化,利用实时定量反转录聚合酶链反应(qRTPCR)于各时间点检测其标志性基因E-钙粘蛋白(CDH1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(VIM)等在表达水平上所发生的变化,并与未处理的空白对照组进行比较。结果加入TGF-β2后,随着时间的推移,人LECs在形态上拉长,呈梭形;上皮细胞标志性基因如CDH1的表达水平逐渐下调,48 h时相对表达量为1.10E-06,和对照组2.68E-06相比差异有统计学意义(P=0.002);间质细胞标志性基因如VIM的表达水平逐渐上调,48 h时相对表达量为1.64E-02,和对照组1.37E-02相比差异有统计学意义(P=0.006);而α-SMA的表达水平也逐渐上升,48 h时相对表达量为9.21E-03,虽和对照组8.67E-03相比差异无统计学意义(P=0.551),但仍呈上升趋势。结论在TGF-β2诱导下,人LECs发生EMT,其形态和基因表型均发生与间质细胞相符的变化。

内质网应激对糖尿病小鼠晶状体上皮细胞发生上皮间质转分化的作用

目的探讨内质网应激对糖尿病小鼠晶状体上皮细胞发生上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用。方法42只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组和糖尿病+4-苯基丁酸(4-PBA)干预模型组。糖尿病模型小鼠由腹腔注射STZ建立,糖尿病+4-PBA干预模型组给予4-PBA溶液灌胃。干预过程中监测各组小鼠体质量及随机血糖水平变化。干预开始后每4周散瞳后于裂隙灯显微镜下观察晶状体混浊情况并照相记录,第12周摘取眼球于体式显微镜下观察晶状体混浊情况。在干预的第1、4、8和12周,采用Western blot方法检测晶状体上皮中葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein,GRP78)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平。结果正常对照组小鼠体质量增加明显,观察期结束时体质量为(30.21±1.47)g,糖尿病模型组及糖尿病+4-PBA干预模型组小鼠体质量增长较正常对照组小鼠缓慢,12周末时分别为(25.32±0.73)g及(25.07±0.67)g。随机血糖监测结果显示糖尿病模型组小鼠各时间点血糖均高于正常对照组(t=13.52、19.45、18.86、21.18、21.56,均为P<0.05),糖尿病+4-PBA干预模型组血糖各时间点均高于正常对照组(t=15.23、18.78、13.04、15.06、13.90,均为P<0.05),第4周起低于糖尿病模型组(t=5.819、6.120、7.664,均为P<0.05)。裂隙灯显微镜下检查结果显示,正常对照组小鼠晶状体维持透明,糖尿病模型组小鼠第8周起晶状体出现浅层皮质点状混浊,糖尿病+4-PBA干预模型组小鼠8周时晶状体出现轻度混浊,但程度较糖尿病模型组轻。离体观察正常对照组晶状体保持透明,糖尿病模型组及糖尿病+4-PBA干预模型组晶状体均出现点状混浊,糖尿病+4-PBA干预模型组混浊程度较轻。Western blot结果显示,与正常对照组相比,糖尿病模型组GRP78蛋白表达量在第12周时明显增高(t=7.153,P<0.05);8周及12周时α-SMA表达量明显升高(t=3.559、4.084,均为P<0.05),各时间点E-cadherin表达量均明显降低(t=4.350、6.139、7.770、3.486,均为P<0.05);糖尿病+4-PBA干预模型组GRP78蛋白表达量低于糖尿病模型组,且在第8周和12周差异均有统计学意义(t=8.600,11.53,均为P<0.05);α-SMA相对表达量在第12周时明显下降(t=4.357,P<0.05),E-cadherin相对表达量在增高且达到正常水平,各时间点差异均有统计学意义(t=4.360、7.633、8.450、5.853,均为P<0.05)。糖尿病+4-PBA干预模型组不同时间点比较,GRP78表达量在8周时达到最低。结论利用分子伴侣4-PBA抑制糖尿病小鼠内质网应激水平能够抑制糖尿病引起的晶状体上皮细胞发生EMT。

miR-451通过Akt负向调控糖尿病肾病患者组织上皮间质转分化

目的研究微小RNA-451(miR-451)对糖尿病肾病组织上皮间质转分化(EMT)的影响。方法取健康人肾脏组织和糖尿病患者肾脏组织,RT-qPCR检测肾组织mi-451、Akt和EMT相关基因(E-钙黏素、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白)的表达;Western blot和免疫组织化学染色(IHC)检测Akt和EMT相关蛋白的表达。结果糖尿病肾病肾脏组织中miR-451和E-钙黏素mRNA表达量显著低于正常肾组织(P<0.05);Akt、vimentin和α-SMA mRNA表达量显著增多(P<0.05);Akt、vimentin和α-SMA蛋白表达量显著增高(P<0.05);E-钙黏素蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论糖尿病肾病时miR-451很可能通过Akt负向影响肾脏上皮间质转分化。

糖肾宁对KK-Ay小鼠足细胞上皮间质转分化的作用研究

目的探讨糖肾宁对KK-Ay小鼠足细胞上皮间质转分化的影响。方法采用KK-Ay小鼠建立糖尿病肾病小鼠模型,随机分为模型组、糖肾宁组及缬沙坦组,每组10只,并将10只C57BL/6J小鼠作为正常对照组。各组小鼠干预给药12周后处死,心尖取血、摘取双侧肾脏,进行相应指标检测。使用酶联免疫法检测血清肌酐及尿素氮水平,PAS染色观察各组小鼠肾组织细胞外基质增生情况,免疫组化检测各组小鼠肾组织Collagen I及FN蛋白表达,WB及RT-PCR检测各组小鼠足细胞P-cadherin和FSP-1的蛋白及mRNA表达。结果(1)与正常对照组相比,模型组小鼠血清肌酐、尿素氮水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,糖肾宁组及缬沙坦组小鼠血清肌酐、尿素氮水平明显降低(P<0.05)。(2)与正常对照组相比,模型组小鼠肾小球细胞外基质明显增生,基质蛋白Collagen I及FN表达上调(P<0.05);与模型组相比,糖肾宁组及缬沙坦组小鼠肾小球细胞外基质增生减轻,基质蛋白Collagen I及FN表达明显下调(P<0.05)。(3)与正常对照组相比,模型组小鼠足细胞P-cadherin蛋白及mRNA表达明显下调(P<0.05),FSP-1蛋白及mRNA表达明显上调(P<0.05);与模型组相比,糖肾宁组及缬沙坦组小鼠足细胞P-cadherin蛋白及mRNA表达明显上调(P<0.05),FSP-1蛋白及mRNA表达明显下调(P<0.05)。结论糖肾宁能够抑制糖尿病肾病小鼠足细胞上皮间质转分化,可能是其减轻肾小球细胞外基质增生、延缓疾病进展的分子机制。

黄芪总皂苷对特发性肺纤维化小鼠上皮间质转分化的干预作用

目的:探讨黄芪总皂苷对博莱霉素(Bleomycin,BLM)诱导的特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)小鼠上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transdifferentiation,EMT)的干预作用。方法:将90只小鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、地塞米松组、黄芪总皂苷高剂量组、黄芪总皂苷中剂量组、黄芪总皂苷低剂量组,每组各15只。模型组及黄芪总皂苷各剂量组小鼠气管内一次性滴注博莱霉素(5 mg·kg^(-1)),造模后,黄芪总皂苷各剂量组以120mg·kg^(-1)、60 mg·kg^(-1)、30 mg·kg^(-1)灌胃,地塞米松组予地塞米松0. 0125 mg·kg^(-1)灌胃,模型组每天予等体积生理盐水灌胃。给药28 d后取材,进行HE、Masson染色分析肺组织形态及胶原蛋白表达水平,羟脯氨酸含量测定胶原蛋白含量,免疫组织化学法检测EMT相关蛋白表达,western-bloting检测TGF-β/smad信号及EMT相关蛋白表达。结果:黄芪总皂苷各剂量组小鼠肺质量指数低于模型组,黄芪总皂苷中剂量组降低明显,但均高于空白组,差异具有统计学意义(P <0. 05)。模型组与空白组比较,羟脯氨酸含量明显增加,而黄芪总皂苷各剂量组羟脯氨酸含量明显下降(P <0. 05);与空白组比较,模型组α-SMA表达增多,黄芪总皂苷各剂量组α-SMA表达比模型组明显减少(P <0. 05);与空白组比较,模型组E-caderin表达减少,黄芪总皂苷各剂量组E-caderin表达增多(P <0. 05)。结论:黄芪总皂苷中剂量组对BLM诱导的肺纤维化小鼠模型EMT抑制作用最好,其抗炎作用优于对胶原纤维的抑制作用。

大黄素对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞上皮间质转分化及Mfn2表达的影响

目的探讨大黄素(EM)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)上皮间质转分化及线粒体融合蛋白2(Mfn2)的影响.方法采用CCK-8法检测不同浓度EM对HK-2细胞增殖的影响;实验分空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+EM(10、20、40μmol/L)组,EM干预组予以不同浓度的大黄素处理HK-2细胞30 min后,TGF-β1组和EM干预组同时给予浓度为10μg/L的TGF-β1刺激48 h收集细胞,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、结缔组织生长因子(CTGF)及Mfn2蛋白的表达.结果CCK-8结果提示0、10、20、40、80、160μmol/L浓度的EM处理组的HK-2细胞存活率(%)分别为100.00±0.00、90.89±2.17、88.52±1.67、87.72±2.00、63.46±1.73、52.19±2.60,呈逐渐降低趋势(P<0.01);Western blot结果表明,与空白对照组比较,TGF-β1刺激后,HK-2细胞中α-SMA、CTGF及Mfn2蛋白水平升高,E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05),与TGF-β1组比较,给予不同浓度大黄素干预后,α-SMA、CTGF及Mfn2蛋白水平降低,E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05),且呈一定剂量依赖性.结论大黄素缓解了TGF-β1诱导的HK-2细胞上皮间质转分化,可能通过减少TGF-β1诱导的Mfn2的表达来减缓肾脏纤维化.

中药干预足细胞上皮间质转分化治疗糖尿病肾病的研究进展

糖尿病肾病是终末期肾病的首要原因,足细胞上皮间质转分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)与糖尿病肾病肾功能减退、蛋白尿的发生及进展有重要关系。中医药治疗糖尿病肾病在临床中疗效确切,但糖尿病肾病发病机制复杂,其分子机制尚未完全阐明。足细胞EMT和多条信号通路有关,如转化生长因子-β、Wnt/β-catenin、整合素连接激酶、Notch、丝裂原活化蛋白激酶、核因子-κB、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路,其中转化生长因子-β作为必需细胞因子可激活其他信号通路。信号通路将受到刺激后产生的细胞外信号分子传递进细胞核内与靶基因结合,促进足细胞EMT。中药单体、单味中药如黄芪甲苷、当归多糖、雷公藤甲素、黄芩苷、丹参和生地黄等在体内外实验中被证明对EMT具有一定的抑制作用。本文从信号通路角度,通过将中药干预足细胞EMT的文献进行整合,筛选出作用于足细胞EMT信号通路的中药并对其功效进行分析,发现益气养阴类、清热祛湿类、活血化瘀类中药在足细胞EMT中的研究较多,在糖尿病肾病治疗中可能发挥足细胞保护的机制,为糖尿病肾病的中药治疗提供思路。

Slit2对高糖诱导的肾小管上皮细胞上皮间质转分化的作用及机制

目的探讨Slit2/ROBO1信号通路在高糖诱导肾小管上皮细胞上皮间质细胞转分化(EMT)中的作用及机制。方法体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,进行高糖浓度梯度实验,随机分为正常组、对照组1、对照组2和高糖组1、高糖组2;同时进行高糖时间梯度实验,随机分为正常组、对照组、高糖24h组、高糖36h组和高糖48h组,采用Western blotting检测HK-2细胞中Slit2、ROBO1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白的表达变化,筛选出最佳高糖刺激浓度和时间。采用Slit2过表达质粒及阴性对照质粒转染HK-2细胞,验证转染成功后,随机分为正常组、对照组、高糖组、高糖+空载组及高糖+Slit2组,经最佳高糖浓度及时间刺激后提取总蛋白,Western blotting检测纤维连接蛋白及α-SMA的表达变化。结果在高糖浓度梯度实验中,与正常组相比,高糖组1、高糖组2的Slit2表达明显下降(分别为0.647±0.048、0.210±0.023vs.1.000±0.050),ROBO1表达明显下降(分别为0.703±0.041、0.303±0.022vs.1.000±0.057),纤维连接蛋白表达明显增加(分别为1.953±0.042、2.997±0.078vs.0.990±0.059),α-SMA表达明显增加(分别为1.767±0.012、2.427±0.059vs.1.033±0.067),差异均有统计学意义(P<0.05)。与高糖组1相比,高糖组2的Slit2、ROBO1表达下降,纤维连接蛋白和α-SMA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。在高糖时间梯度实验中,与正常组相比,高糖36h组、高糖48h组的Slit2表达明显下降(分别为0.557±0.020、0.450±0.055vs.0.943±0.032),ROBO1表达下降(分别为0.600±0.023、0.227±0.028vs.1.000±0.058),高糖24h组、高糖36h组、高糖48h组纤维连接蛋白表达增加(分别为1.247±0.052、1.733±0.084、2.780±0.090vs.0.970±0.040),α-SMA表达增加(分别为1.277±0.041、1.767±0.120、2.537±0.078vs.1.033±0.067),差异均有统计学意义(P<0.05)。与高糖24h组相比,高糖36h组、高糖48h组的Slit2表达下降(分别为0.557±0.020、0.450±0.055vs.0.893±0.034),ROBO1表达下降(分别为0.600±0.023、0.227±0.028vs.0.930±0.025),纤维连接蛋白及α-SMA表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。与高糖36h组相比,高糖48h组的Slit2和ROBO1表达下降,纤维连接蛋白和α-SMA表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。在高糖环境下,Slit2过表达及阴性对照质粒转染成功后,观察Slit2过表达对肾小管EMT的影响发现,与正常组相比,高糖组、高糖+空载组、高糖+Slit2组的纤维连接蛋白表达增加(分别为2.760±0.012、2.667±0.027、1.460±0.034vs.1.000±0.058),α-SMA表达水平增加(分别为2.487±0.048、2.557±0.037、1.270±0.017vs.1.000±0.050),差异有统计学意义(P<0.05)。与高糖+空载组相比,高糖+Slit2组的纤维连接蛋白和α-SMA表达下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论Slit2和ROBO1的表达下降参与了高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT过程,过表达Slit2可显著抑制高糖诱导的EMT。

Ano1在TGF-β1介导的肠道上皮细胞上皮间质转分化中的作用

目的探讨Ano1在TGF-β1诱导大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC6)上皮间质转分化(EMT)中的作用。方法TGF-β1组采用10 ng/ml TGF-β1刺激IEC6 72 h,以无血清培养为正常对照组,观察细胞形态。RT-PCR法检测Ano1 mRNA水平,Western blot检测E-cadherin、Vimentin、Fribronectin、α-SMA及Ano1蛋白表达。应用慢病毒转染技术建立过表达Ano1细胞系(IEC6-Ano1),以空载体为对照组(IEC6-NC)。再次利用10 ng/ml TGF-β1刺激IEC6-Ano1 72 h后建立IEC6-Ano1+TGF-β1组,观察该组与正常对照组、IEC6-NC组的细胞形态,Western blot检测E-cadherin、Vimentin、Fribronectin、α-SMA表达水平。结果与正常对照组相比,TGF-β1组IEC6细胞形态出现间质化改变,E-cadherin表达降低,Vimentin、Fribronectin、α-SMA蛋白表达升高(P<0.001),Ano1 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。与正常对照组及IEC6-NC组比较,IEC6-Ano1+TGF-β1组细胞形态无明显改变,E-cadherin、Vimentin、Fribronectin及α-SMA蛋白表达水平无统计学差异。结论研究显示Ano1可通过抑制TGF-β1介导的IEC6细胞EMT过程,从而缓解肠道纤维化。

内质网应激在肺泡上皮间质转分化发生中的作用

目的探讨衣霉素诱导的内质网应激在肺泡上皮细胞-间质转分化(EMT)中的影响及作用机制。方法以质量浓度为1.25、2.5、5.0 mg/L的衣霉素(TM)分别处理人肺腺癌上皮细胞A549 24 h,MTT法检测细胞活力;RTPCR和免疫印迹法检测GRP78、CHOP、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、Smad2/3、转录因子Snail的表达;以5μg/L TGF-β1分别处理A549细胞24 h或48 h后,免疫印迹法检测GRP78和p-e IF2α的表达。结果 1.25 mg/L的TM处理A549细胞24 h后,GRP78 mRNA和蛋白表达升高,CHOP mRNA表达上调;E-cadherin蛋白表达下降,Smad2/3活化,Snail表达上调。而TGF-β1处理A549 24 h,GRP78和p-eIF2α表达均上调。结论衣霉素诱导的内质网应激可介导A549细胞发生EMT,同时EMT发生过程中伴随着内质网应激的发生。

IL-33调控NF-κB/Twist信号通路促进肺泡上皮细胞上皮-间质转分化的机制研究

目的:探究IL-33是否通过激活NF-κB/Twist信号通路,进而诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生上皮-间质转分化(EMT)而促进肺纤维化(PF)的进程。方法:C57BL/6小鼠48只,随机分成对照(CON)组、博莱霉素(BLM)组、BLM+IL-33(30μg/kg)组和BLM+抗IL-33抗体(Anti-IL-33 Ab)(100μg/kg)组,每组12只。气管注射BLM(5000 U/kg)诱导PF小鼠模型。造模后每隔1 d腹腔注射1次重组IL-33和抗IL-33抗体,连续注射3周。HE和Masson染色观察肺组织病理变化及胶原沉积情况。ELISA检测血浆IL-33的水平。免疫组化检测肺组织IL-33跨膜受体ST2L的表达。体外培养小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞,实验设Control组、IL-33(100 ng/ml)组、IL-33^(+)二甲基亚砜(DMSO)组及IL-33^(+)吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC,100μmol/L)组,每组设复孔6个。细胞先用PDTC或DMSO预处理1 h,再用IL-33处理48 h。RT-PCR检测肺组织或肺泡上皮细胞中CollagenⅠ、CollagenⅢ、E钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA的表达。Western blot检测肺组织和(或)肺泡上皮细胞IL-33、CollagenⅠ、CollagenⅢ、E-cadherin、Vimentin、α-SMA、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表达及细胞核内NF-κB p65和Twist的蛋白水平。结果:体内实验,与CON组相比,BLM组IL-33、ST2L的表达明显升高,p-IκBα、p-NF-κB p65及核内NF-κB p65和Twist的蛋白水平显著升高,肺组织E-cadherin的表达明显下调而Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达明显上调(P<0.05)。与BLM组相比,IL-33组IL-33、ST2L的表达进一步升高,p-IκBα、p-NF-κB p65及核内NF-κB p65和Twist的蛋白水平进一步增加,肺组织E-cadherin的表达进一步下调而Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达进一步上调(P<0.05),肺纤维化程度进一步加重;而Anti-IL-33 Ab的作用正好和IL-33的作用相反。体外实验,IL-33能够明显增加细胞内IκBα、NF-κB p65磷酸化水平,显著增加细胞核内NF-κB p65和Twist蛋白水平,明显下调E-cadherin的表达而显著上调Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达(P<0.05)。而IL-33的这些作用能够被NF-κB抑制剂PDTC所逆转。结论:IL-33可能通过激活NF-κB信号通路而促使转录因子Twist的表达,进而诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT而导致PF发生。

miR-21对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞间质转分化的影响

目的:观察miR-21在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)上皮间质转分化(EMT)中的作用,并探讨miR-21参与调控HK-2细胞EMT的可能靶点。方法:体外培养的HK-2细胞分为6组:正常对照组、转化生长因子β1(TGF-β1)模型组、miR-21 mimic阴性组、miR-21 mimic组、miR-21 inhibitor阴性组和miR-21 inhibitor组。细胞经4 ng/ml TGF-β1处理建立EMT模型,检测miR-21和EMT相关指标的表达变化,利用基因转染技术,将miR-21 mimic质粒或miR-21 inhibitor质粒转染经TGF-β1处理的HK-2细胞,使细胞过表达或抑制表达miR-21,在此基础上观察细胞EMT相关指标的变化以及磷酸酯酶(PTEN)基因的影响。结果:(1)与正常组相比,模型组的miR-21含量显著升高(P<0.05),上皮表型标志物E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),间质表型标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白水平也显著升高(P<0.05,P<0.01);(2)转染miR-21 mimic后,与miR-21 mimic阴性对照组相比,miR-21含量显著升高(P<0.01),PTEN、E-cadherin的mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05,P<0.01),α-SMA mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05,P<0.01);转染miR-21 inhibitor后,与miR-21 inhibitor阴性对照组相比,miR-21含量显著降低(P<0.01),PTEN、E-cadherin的mRNA和蛋白含量显著升高(P<0.05,P<0.01),α-SMA mRNA、蛋白水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论:miR-21在TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT发生中具有重要作用,并且可能通过靶基因PTEN参与EMT相关分子的表达调控。

ERK1/2信号通路在高糖诱导的HK-2上皮间质转分化中的作用

目的观察高糖诱导的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)信号通路活化在上皮间质转分化中的作用,从而探讨延缓糖尿病肾病肾间质纤维化的发生机制。方法体外培养HK-2细胞,随机分为正常对照组、高糖组、ERK1/2通路抑制剂PD98059+高糖组和高渗组,处理72 h后收集细胞,应用免疫细胞化学方法检测α-SMA、CK18的表达;应用Western blot法检测磷酸化ERK1/2、总ERK1/2表达水平的变化。结果 (1)正常对照组胞质有大量CK18蛋白阳性表达,而α-SMA蛋白表达呈阴性;高糖组胞质中可见大量α-SMA蛋白强阳性染色,而CK18蛋白呈阴性表达;经PD98059处理后,CK18表达较高糖组染色深,而α-SMA表达较高糖组染色浅;高渗组胞质中CK18呈阳性表达,α-SMA表达呈阴性。(2)正常对照组可见少量总ERK1/2表达,p-ERK1/2蛋白仅有微量表达;经高糖刺激48 h后,总ERK1/2表达较正常对照组无明显差异,p-ERK1/2蛋白表达明显增加(P<0.05);而使用PD98059处理后,总ERK1/2的变化不大,但p-ERK1/2蛋白的表达却显著降低(P<0.05);高渗组与正常对照组无显著差异。结论 ERK1/2信号通路可能参与了高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)转分化过程,阻断ERKl/2可部分抑制人近端肾小管上皮细胞的转分化,进而延缓肾小管间质纤维化的发生和发展。

PI3K抑制剂对高糖环境下大鼠肾小球足细胞上皮间质转分化的影响

目的探讨磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂对高糖环境下肾小球足细胞上皮间质转分化(EMT)的影响。方法体外培养原代大鼠肾小球足细胞,分为NG组(葡萄糖5mmol/L)、MG组(甘露醇30 mmol/L)、HG组(葡萄糖30 mmol/L)、HG+LY294002组(葡萄糖30 mmol/L+LY294002 2mg/L),培养48h后检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-cadherin蛋白的表达情况。结果 HG组足细胞足突消失及失去细胞间连接。与NG组比较,HG组α-SMA蛋白表达增多,E-cadherin蛋白表达减少(P<0.05);与HG组相比,HG+LY294002组α-SMA蛋白表达减少,E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05)。结论高糖导致足细胞损伤发生EMT,PI3K抑制剂可部分阻断EMT的发生。

叉头状转录因子O1对高糖环境下小鼠足细胞上皮间质转分化的影响及机制研究

目的 研究叉头状转录因子O1（FoxO1）调节高糖下小鼠足细胞上皮间质转分化及与转化生长因子β1（TGF-β1）/Smad3信号通路的关系。 方法 分别将持续激活突变型FoxO1慢病毒载体（LV-CA-FoxO1）、FoxO1短发夹样RNA慢病毒载体（LV-FoxO1-shRNA）和空慢病毒载体（LV-NC）转染足细胞。实验分5组：正常糖浓度组（5.6 mmol/L，A组）、高糖组（25 mmol/L，B组）、高糖＋LV-CA-FoxO1组（C组）、高糖＋LV-FoxO1-shRNA组（D组）、高糖＋LV-NC组（E组）。各组培养24、48、72 h后，实时荧光定量PCR、免疫印迹法检测FoxO1、TGF-β1、Smad3、nephrin、desmin的表达水平；细胞免疫荧光法观察FoxO1在足细胞中的定位；酶联免疫吸附法检测72 h上清中TGF-β1水平。 结果 与A组相比，B组FoxO1 mRNA及蛋白表达无变化（均P〉0.05），磷酸化FoxO1（p-FoxO1）/FoxO1升高，TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达升高，p-Smad3/Smad3升高，nephrin表达减少，desmin表达增多，且nephrin及desmin变化呈时间依赖性（均P〈0.05）。与B组相比，C组FoxO1 mRNA及蛋白表达升高，p-FoxO1/FoxO1降低，TGF-β1表达减少，p-Smad3/Smad3降低，nephrin表达增多，desmin表达减少（均P〈0.05）。D组与B组相比，FoxO1 mRNA及蛋白表达降低，p-FoxO1/FoxO1降低，TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达升高，p-Smad3/Smad3降低，nephrin表达降低，desmin表达升高（均P〈0.05）。 结论 FoxO1可通过抑制TGF-β1/Smad3传导通路的激活，抑制高糖下足细胞发生上皮间质转分化。