IL-33调控NF-κB/Twist信号通路促进肺泡上皮细胞上皮-间质转分化的机制研究

目的:探究IL-33是否通过激活NF-κB/Twist信号通路,进而诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生上皮-间质转分化(EMT)而促进肺纤维化(PF)的进程。方法:C57BL/6小鼠48只,随机分成对照(CON)组、博莱霉素(BLM)组、BLM+IL-33(30μg/kg)组和BLM+抗IL-33抗体(Anti-IL-33 Ab)(100μg/kg)组,每组12只。气管注射BLM(5000 U/kg)诱导PF小鼠模型。造模后每隔1 d腹腔注射1次重组IL-33和抗IL-33抗体,连续注射3周。HE和Masson染色观察肺组织病理变化及胶原沉积情况。ELISA检测血浆IL-33的水平。免疫组化检测肺组织IL-33跨膜受体ST2L的表达。体外培养小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞,实验设Control组、IL-33(100 ng/ml)组、IL-33^(+)二甲基亚砜(DMSO)组及IL-33^(+)吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC,100μmol/L)组,每组设复孔6个。细胞先用PDTC或DMSO预处理1 h,再用IL-33处理48 h。RT-PCR检测肺组织或肺泡上皮细胞中CollagenⅠ、CollagenⅢ、E钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA的表达。Western blot检测肺组织和(或)肺泡上皮细胞IL-33、CollagenⅠ、CollagenⅢ、E-cadherin、Vimentin、α-SMA、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表达及细胞核内NF-κB p65和Twist的蛋白水平。结果:体内实验,与CON组相比,BLM组IL-33、ST2L的表达明显升高,p-IκBα、p-NF-κB p65及核内NF-κB p65和Twist的蛋白水平显著升高,肺组织E-cadherin的表达明显下调而Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达明显上调(P<0.05)。与BLM组相比,IL-33组IL-33、ST2L的表达进一步升高,p-IκBα、p-NF-κB p65及核内NF-κB p65和Twist的蛋白水平进一步增加,肺组织E-cadherin的表达进一步下调而Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达进一步上调(P<0.05),肺纤维化程度进一步加重;而Anti-IL-33 Ab的作用正好和IL-33的作用相反。体外实验,IL-33能够明显增加细胞内IκBα、NF-κB p65磷酸化水平,显著增加细胞核内NF-κB p65和Twist蛋白水平,明显下调E-cadherin的表达而显著上调Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达(P<0.05)。而IL-33的这些作用能够被NF-κB抑制剂PDTC所逆转。结论:IL-33可能通过激活NF-κB信号通路而促使转录因子Twist的表达,进而诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT而导致PF发生。

百令胶囊对肾小管间质纤维化大鼠肾小管上皮-间质转分化的干预作用(英文)

目的探讨百令胶囊对小管间质纤维化大鼠小管上皮-间质转分化的干预作用。方法利用腺嘌呤诱导建立肾小管间质纤维化大鼠模型,实验SD大鼠随机分为模型组、干预组、对照组各30只,分别于实验第7周、12周、17周收获动物各10只,进行功能学和肾脏组织病理学检测和观察。利用免疫组织化学对骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和α-平滑肌肌动蛋白(-αSMA)在肾小管间质纤维化大鼠中的表达变化进行动态观察及百令胶囊的干预影响。结果实验第7周模型组大鼠即表现出大量蛋白尿、小管损伤、间质的轻度纤维化和炎症细胞浸润(P<0.01);随病程进展,上述病变呈进行性加重(P<0.01)。百令胶囊干预组动物在实验第7周、12周功能学组织学的改善同实验组相比有明显差异(P<0.01),17周后二者无显著差异。免疫组织化学显示百令胶囊12周前能显著上调BMP-7的表达和降低-αSMA和TGF-β1在肾脏小管间质中的表达(P<0.01),12周后这种变化无差异。结论百令胶囊在发病早期通过有效干预上皮-间质转分化达到改善肾脏纤维化的作用,随着肾小管间质纤维化程度的加重,百令胶囊逐渐失去其阻断作用。

Gli-1在缺氧诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮-间质转分化中的重要作用

目的探讨Gli-1在缺氧诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮-间质转分化(EMT)及侵袭中的重要作用。方法通过缺氧培养乳腺癌MDA-MB-231细胞,以常氧培养作为对照。Transwell小室侵袭试验检测各组MDAMB-231细胞的侵袭能力;Western blot检测HIF-1α、Gli-1、E-Cadherin和vimentin蛋白的表达水平。通过shRNA稳定转染乳腺癌细胞,再次通过Transwell小室侵袭试验检测缺氧对乳腺癌细胞侵袭能力的影响,Western blot检测HIF-1α、Gli-1、E-Cadherin和vimentin蛋白的表达水平。结果缺氧可明显诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭,并上调HIF-1α、Gli-1和vimentin蛋白,下调E-cadherin蛋白。靶向沉默Gli-1基因后,缺氧失去了对乳腺癌细胞侵袭和EMT的诱导作用。结论缺氧通过上调Gli-1表达活化Hedgehog通路,诱导乳腺癌细胞侵袭及EMT过程。

黄芪注射液对肺纤维化小鼠肺组织上皮-间质转分化的影响

目的观察黄芪注射液对肺纤维化小鼠肺组织上皮-间质转分化(EMT)的影响,研究其对肺泡上皮细胞EMT过程的干预作用及可能机制。方法将30只实验小鼠随机平均为纤维化组、黄芪组、PBS对照组。纤维化组小鼠气管内灌注博莱霉素3 mg/kg;PBS对照组小鼠于气管灌注等量PBS;黄芪组小鼠给予气管灌注博莱霉素3 mg/kg,并且于实验造模后10 d腹腔注射黄芪注射液5 m L/kg,连续给药2周。实验第24天处死小鼠,肺组织切片行Masson染色观察肺组织病理改变,碱裂解法检测肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量,ELISA法检测小鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和转化生长因子-β1(TGF-β1)水平,Western blot法检测肺组织中上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达量。结果与纤维化组比较,黄芪组小鼠肺组织肺纤维化病理损伤明显减轻,胶原沉积减少;黄芪组小鼠肺组织中HYP含量和α-SMA蛋白表达量均明显低于纤维化组(P均<0.05),E-cadherin蛋白表达量明显高于纤维化组(P<0.05);黄芪组血清TNF-α和TGF-β1水平均明显低于纤维化组(P均<0.05)。结论黄芪注射液能下调TNF-α和TGF-β1表达,抑制肺泡上皮细胞EMT现象,从而改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化病理改变。

miRNA-184在TGF-β_2诱导人晶状体上皮细胞上皮-间质转分化中的表达

目的研究miRNA-184(miR-184)在转化生长因子β_2(transforming growth factor β_2,TGF-β_2)诱导人晶状体上皮细胞上皮-间质转分化过程中的表达及意义。方法应用不同浓度(0μg·L^(-1)、1μg·L^(-1)、5μg·L^(-1)、10μg·L^(-1)、15μg·L^(-1))TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞发生上皮-间质转分化,细胞免疫荧光和Western blot方法观察转分化相关分子波形蛋白(Vimentin)、钙黏附蛋白E(E-Cadherin)的表达;应用qRT-PCR检测miR-184在不同浓度(0μg·L^(-1)、1μg·L^(-1)、5μg·L^(-1)、10μg·L^(-1)、15μg·L^(-1))TGF-β_2、不同作用时间(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h)TGF-β_2(10μg·L^(-1))诱导人晶状体上皮细胞转分化中的表达变化。结果随着TGF-β_2浓度的增加,细胞胞浆中Vimentin荧光强度增强;E-Cadherin蛋白表达逐渐减少,各组细胞间E-Cadherin表达量差异有统计学意义(F=87.617,P<0.01);Vimentin蛋白表达逐渐增加,各组细胞间Vimentin表达量差异有统计学意义(F=68.923,P<0.01)。随着TGF-β_2浓度的增加,细胞中miR-184相对表达量增多,在10μg·L^(-1) TGF-β_2诱导组达到峰值;随着TGF-β_2诱导时间的延长,细胞中miR-184相对表达量增加,在24 h表达达到峰值。结论 TGF-β_2诱导人晶状体上皮细胞发生上皮-间质转分化时细胞内miR-184表达增加,并与诱导浓度和时间有关,为进一步研究miR-184在人晶状体上皮细胞上皮-间质转分化中的作用及机制提供实验基础。

吉非替尼通过增加Foxo3a活性抑制肺纤维化小鼠上皮-间质转分化

目的:研究吉非替尼对肺纤维化小鼠转录因子叉头框蛋白O3a(Foxo3a)活性、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平及相关通路的影响,探讨吉非替尼抑制肺上皮-间质转分化的可能机制。方法:将30只SPF级雌性昆明小鼠随机分为3组:对照组(生理盐水气管内雾化)、博来霉素组(博来霉素3 mg/kg溶于100μL生理盐水气管内雾化)和吉非替尼处理组(博来霉素气管内雾化后,每天吉非替尼20 mg/kg溶于100μL生理盐水灌胃)。实验第14天收集样本,将小鼠肺组织置于10%中性甲醛固定,石蜡包埋切片后行HE与Masson染色;RT-PCR法检测Foxo3a和α-SMA mRNA表达水平;Western blotting法检测表皮生长因子受体(EGFR)、Akt、Foxo3a和α-SMA蛋白表达水平。结果:吉非替尼处理组小鼠肺组织病理损伤较博来霉素组明显减轻,胶原沉积明显减少,炎症损伤评分及纤维化评分明显下降(均P<0.01),Foxo3a mRNA表达水平明显升高(P<0.05),α-SMA mRNA表达水平明显下降(P<0.05),总Foxo3a蛋白表达增加,但Foxo3a磷酸化水平显著下降(P<0.01),胞核Foxo3a蛋白明显增加(P<0.05);同时,EGFR和Akt磷酸化水平也显著下降(P<0.01,P<0.05),上皮-间质转分化标志蛋白α-SMA表达水平明显降低(P<0.05)。结论:吉非替尼抑制博来霉素诱导的肺纤维化,其机制可能与抑制EGFR/Akt通路活化、增强转录因子Foxo3a活性、从而抑制上皮-间质转分化密切相关。

转化生长因子-β_2(TGF-β_2)诱导人视网膜色素上皮层细胞上皮-间质转分化中miRNA-29b的表达及意义

目的探究转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)诱导人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)层细胞上皮-间质转分化中miRNA-29b的表达变化及意义。方法使用不同浓度TGF-β2刺激RPE细胞上皮-间质转分化后,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,Western blot、RT-PCR检测成纤维化相关分子纤维连接蛋白(fibronection,FN)、神经钙粘连蛋白(nerve calcium adhesion protein,N-Cadherin)的表达。采用RT-PCR检测不同浓度TGF-β2及不同时间TGF-β2(5μg·L^(-1))刺激RPE细胞后miRNA-29b的表达。结果 TGF-β2刺激后的RPE细胞形态呈纤维化改变。在一定浓度范围内(1μg·L^(-1)、5μg·L^(-1)、10μg·L^(-1)),随着TGF-β2浓度的增加FN、N-Cadherin及相应mRNA随之增加,1μg·L^(-1)、5μg·L^(-1)、10μg·L^(-1)组与对照组(0μg·L^(-1))相比,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。TGF-β2在一定浓度范围内(0μg·L^(-1)、1μg·L^(-1)、5μg·L^(-1))以剂量依赖的方式诱导RPE细胞miRNA-29b表达的降低,1μg·L^(-1)、5μg·L^(-1)、10μg·L^(-1)组与对照组(0μg·L^(-1))相比,差异均有统计学意义(均为P<0.01),在TGF-β2浓度为5μg·L^(-1)时miRNA-29b表达量最低。TGF-β2在一定时间范围内(0 h、3 h、6 h、12 h)以时间依赖的方式诱导RPE细胞miRNA-29b表达的降低,3 h、6 h、12 h、24 h、48 h组与0 h相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论一定范围内TGF-β2以剂量和时间依赖的方式诱导RPE细胞miRNA-29b的表达,为进一步研究miRNA-29b与TGF-β2在RPE细胞上皮-间质转分化过程中的相互作用提供理论基础。

转化生长因子β1对肠道上皮-间质转分化影响的体外研究

目的通过体外实验探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对肠道上皮-间质转分化(EMT)的影响。方法以浓度为10 ng/ml的TGF-β1刺激肠道上皮细胞株DLD-1,分别在24、48或72 h时,提取细胞总RNA和总蛋白;分别用real-time PCR和Western-blot法检测细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在mRNA和蛋白水平的表达变化。结果TGF-β1刺激后各个时间点E-cadherin表达显著下降,而N-cadherin、vimentin、fibronectin、α-SMA的表达则明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TGF-β1可促进肠上皮细胞EMT过程,可能参与肠道纤维化发病机制。

JNK对TGF-β_1诱导的人肺上皮-间质转分化的调控作用

目的探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肺上皮细胞A549转分化中的调控作用。方法将体外培养的人肺上皮细胞(A549)随机分成3组:正常对照组、TGF-β1组(加入10ng/mL TGF-β1)及抑制剂组(加入10ng/mL TGF-β1和20μmol/L JNK的特异性抑制剂Sp600125),培养于3%的血清培养液中,光镜下观察3组细胞形态的变化,并通过RT-PCT检测各组A549细胞的上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)及间充质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和胶原纤维Ⅰ(collagen fibersⅠ,ColⅠ)的表达的变化,Western blot检测JNK磷酸化(p-JNK)水平的变化。结果正常对照组体外培养的A549细胞光镜下为鹅卵石样紧密排列生长,有E-cad表达及微量的α-SMA、ColⅠ及p-JNK表达。TGF-β1组培养72h后细胞基本长成梭形、纺锤形,E-cad表达下调,α-SMA、ColⅠ及p-JNK表达上调。与TGF-β1组比较,抑制剂组培养72h后细胞梭形有所逆转,E-cad表达上调,α-SMA、ColⅠ及p-JNK表达明显抑制;与正常对照组比较,细胞形态较扁长,E-cad、α-SMA、ColⅠ及p-JNK表达差异无统计学意义。结论 JNK信号通路参与TGF-β1介导的人肺上皮-间质转分化过程,JNK的特异性抑制剂Sp600125可有效抑制该过程。

沙利度胺对肺泡上皮细胞上皮-间质转分化的作用

目的探讨沙利度胺对A549上皮-间质转分化的作用,阐明其抗肺纤维化的机理。方法 A549细胞分为3组,A:对照组;B:TGF-β1+DMSO组;C:TGF-β1+沙利度胺组。通过免疫印迹法检测A549细胞磷酸化p38 MAPK和JNK的蛋白,以及间质表型蛋白和上皮表型蛋白的表达;实时荧光定量PCR方法检测A549细胞p38 MAPK和JNK mRNA的表达。结果沙利度胺显著抑制(P<0.05)TGF-β1诱导的A549细胞间质表型蛋白表达增加,可阻止(P<0.05)A549细胞上皮表型蛋白表达的减少,显著减少活性MAPK蛋白及mRNA的表达(P<0.05)。结论沙利度胺可能通过p38MAPK和JNK信号通道,从而抑制肺泡上皮细胞的上皮-间质转分化过程而发挥抗纤维化作用。

消瘀泄浊饮对单侧输尿管梗阻大鼠肾小管上皮-间质转分化及PAR-3表达的影响

[目的]通过检测极性蛋白-3(partitioning defective-3,PAR-3)在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)所导致的肾间质纤维化大鼠中的表达,探讨消瘀泄浊饮对肾小管上皮-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。[方法]将40只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型(UUO)组、西药(贝那普利)组和中药(消瘀泄浊饮)组。从术后1 d起,每天分别给予消瘀泄浊饮药液10.4 g/(kg·d)和盐酸贝那普利溶液1 mg/(kg·d)灌胃,假手术组和模型组以等体积0.9%氯化钠注射液灌胃4周。给药结束后分别检测白蛋白(albumin,ALB)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,Scr)、尿酸(uric acid,UA)水平;取手术侧肾组织分别采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色及Masson染色进行相关病理检测;采用免疫荧光和免疫印迹法分别检测肾组织PAR-3的表达;采用免疫组化检测肾组织E-钙黏蛋白(E-cadherin)及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)蛋白的表达。[结果]与假手术组比较,模型组、西药组、中药组BUN、Scr、UA水平均增高,差异有统计学意义(均P<0.05);与模型组比较,中药组BUN、Scr、UA水平均降低,差异有统计学意义(均P<0.05);与西药组比较,中药组Scr、UA水平均降低,差异有统计学意义(均P<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠肾小管间质损伤指数和肾间质纤维化相对面积均升高(均P<0.05);与模型组比较,西药组、中药组肾小管间质损伤指数和肾间质纤维化相对面积均降低(均P<0.05)。与假手术组比较,其余各组大鼠肾组织PAR-3水平均下降(均P<0.05);与模型组比较,中药组肾组织PAR-3表达升高(P<0.05)。与假手术组比较,其余各组大鼠肾组织α-SMA表达增加,E-cadherin表达减少(均P<0.05);与模型组比较,西药组、中药组大鼠肾组织α-SMA表达减少,E-cadherin表达增加(均P<0.05)。[结论] UUO大鼠肾组织PAR-3表达减少,消瘀泄浊饮能通过上调肾组织PAR-3表达、阻止肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化,起到改善肾间质纤维化的作用。

五味子合剂通过Wnt/β-catenin通路改善糖尿病肾病大鼠肾小管上皮-间质转分化的机制研究

目的:探究五味子合剂(SM)通过调控Wnt/β-catenin通路改善糖尿病肾病(DN)肾小管上皮-间质转分化(EMT)的作用及机制。方法:采取高糖高脂饲料联合腹腔小剂量注射链脲佐菌素(35mg/kg)构建DN大鼠模型。将造模成功的DN大鼠随机分为模型组,五味子合剂低、中、高剂量(1.5、3、6g·kg^(-1)·d^(-1))组和氯沙坦钾(20mg·kg^(-1)·d^(-1))组,另设对照组,每组6只。连续给药12周。12周后处死大鼠,记录体质量、右肾质量、血糖和24h尿蛋白定量(24hUTP),收取血清和肾组织标本。试剂盒测定大鼠Scr和BUN水平;HE、Masson染色观察肾组织病理变化;TEM观察肾组织超微结构变化;Western Blot检测大鼠肾组织Wnt4、β-catenin、E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白表达;免疫组化检测大鼠肾组织β-catenin、E-cadherin、Vimentin、α-SMA的蛋白表达和定位。结果:与对照组比较,模型组大鼠肾质量/体质量比,血糖、24hUTP、Scr和BUN水平显著升高(P<0.01);肾脏病理表现为肾小球肥大、基底膜增厚、系膜增生、足突融合、足细胞丢失;肾组织中Wnt4、β-catenin、Vimentin、α-SMA表达增加,E-cadherin的表达下降(P<0.01)。与模型组比较,氯沙坦钾组和SM各剂量组大鼠肾质量/体质量比、24hUTP、Scr和BUN水平不同程度降低;肾组织中Wnt4、β-catenin、Vimentin、α-SMA蛋白表达不同程度下降,E-cadherin的蛋白表达不同程度升高(P<0.05,P<0.01)。结论:SM可以改善DN大鼠的肾功能和病理损伤,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路,改善EMT有关。

EGFR对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化中上皮-间质转分化的影响

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)在肺内的表达对博莱霉素(BLM)诱导小鼠肺纤维化中上皮-间质转分化的影响。方法:将40只4～6周龄C57BLB/c雄性小鼠随机分为正常对照组(气管滴入PBS),纤维化组(气管滴入BLM 3 mg/kg),EGFRRNAi组(气管滴入BLM 3 mg/kg+气管滴入siRNA 20μl)和RNAi阴性对照组(气管滴入BLM 3 mg/kg+气管滴入siRNA阴性对照20μl)。实验第10天处死小鼠,收获肺组织,检测羟脯氨酸含量;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测EGFR和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA的表达;肺组织切片行HE染色观察肺组织病理改变,免疫组化染色检测EGFR和α-SMA表达。结果:纤维化组EGFR和α-SMA两者的mRNA和蛋白表达均较正常对照组显著增加;RNAi组肺病理损伤较纤维化组减轻,气道上皮下胶原沉积及肺羟脯氨酸含量减少(P<0.05),肺组织EGFR和α-SMA两者的mRNA和蛋白表达均较纤维化组显著下降(P<0.05)。结论:在博来霉素诱导的肺纤维化中EGFR RNAi抑制EGFR活化,下调α-SMA的表达,减轻了博莱霉素诱导的肺纤维化病理改变。其抑制肺纤维化病理过程可能与其抑制上皮-间质转分化(EMT)有关。

肾小管上皮细胞间质转分化过程中E-cadherin和α-SMA基因启动子区甲基化状态研究

目的:了解大鼠肾小管上皮细胞间质转分化与E-钙黏附蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因启动子区甲基化状态之间的关系。方法:将大鼠肾小管上皮细胞分为对照组和TGF-β1处理组。对两组细胞采用免疫细胞化学方法检测E-cadherin和α-SMA蛋白表达情况,用ELISA法检测培养液中Ⅰ型胶原蛋白的含量。同时分别提取两组细胞中的基因组DNA,应用焦磷酸测序技术对E-cadherin和α-SMA基因启动子区甲基化水平进行检测。结果:TGF-β1处理组细胞中Ecadherin基因启动子区有2个CpG位点甲基化频率高于对照组,而α-SMA基因启动子区有2个CpG位点甲基化频率低于对照组。结论:E-cadherin和α-SMA基因启动子区甲基化状态的改变参与了肾小管上皮细胞间质转分化过程。

HES5对肾小管上皮细胞转分化和凋亡的影响及其机制研究

目的探讨HES5(hairy and enhancer of split 5)对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和凋亡的作用及其潜在机制。方法分析和筛选GSE66494数据中的差异表达基因。建立小鼠的输尿管梗阻模型(unilateral uretera obstruction,UUO),检测肾组织中HES5的表达水平。TGF-β1(10 ng/mL)处理HK-2细胞24 h建立肾小管上皮-间质转化模型后,通过qRT-PCR和Western blot检测HES5的表达水平。用过表达HES5的质粒转染HK-2细胞,24 h后检测其纤连蛋白(Fibronectin,FN)、胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)和波形蛋白(Vimentin)及凋亡相关标志物(Bax、Bcl2)等蛋白表达;然后,将HK-2细胞分为4组:Control组、siHES5组、TGF-β1组、siHES5+TGF-β1组,检测各组的纤维化及凋亡标志物的表达情况。运用TUNEL及流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。Western blot检测各组AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K的蛋白表达。通过加入PI3K抑制剂(LY294002)处理过表达HES5的HK-2细胞后,检测Vimentin的表达。结果HES5的表达在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)和小鼠纤维化肾组织中均显著上调;过表达HES5可以促进HK-2细胞中FN、CollagenⅠ、Vimentin、Bax的合成,抑制Bcl2的表达(P<0.05);敲低HES5不仅下调纤维化标志物的表达,还抑制了肾小管上皮细胞凋亡;此外,HES5基因敲低使TGF-β1诱导的HK-2细胞内PI3K/AKT信号通路的激活程度降低(P<0.05);PI3K/AKT信号通路抑制剂减弱了HES5对Vimentin的诱导作用。结论敲低HES5可以抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和凋亡,这可能与PI3K/AKT信号通路活性降低有关。

STZ诱导的糖尿病模型小鼠肾脏的上皮-间质转分化研究

目的:探讨STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏发生上皮-间质转分化(EMT)的情况。方法:将80只C57BL小鼠随机分为正常对照组(NC组)和糖尿病组(DM组),每组40只。DM组小鼠用1%STZ(streptozotocin,链脲佐菌素)溶液按60mg/kg体质量的剂量进行腹腔注射,每天1次,连续6天。NC组小鼠平行腹腔注射同等体积0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液。再将成模小鼠随机分为A、B批次,A批次用于动态观察生存率、小鼠体质量及随机血糖的监测;B批次用于在造模后第4、8、12周末观察肾组织的病理变化,并用Western blot、免疫荧光染色的方法观察肾组织中EMT标志蛋白α-SMA和E-cadherin的表达。结果:STZ诱导的糖尿病模型小鼠出现糖尿病典型症状如多饮、多尿等,血糖持续在高水平状态,体质量增长缓慢。在造模后12周末,DM组小鼠较NC组小鼠累积生存率显著降低,两组比较差异具有统计学意义(P<0.001)。在造模后的第8周末,DM组小鼠肾脏出现明显的病理改变,到第12周末时,绝大部分肾小管上皮细胞被梭形的肌成纤维细胞取代,肾小球空泡,基底膜增厚。造模后的第4、8、12周末时,DM组小鼠E-cadherin表达量均显著低于NC组小鼠(P=0.004,0.026,0.004);而在第8和12周末时,DM组α-SMA表达量显著升高(P=0.009,0.015)。在第12周末,肾组织冰冻切片E-cadherin和α-SMA、免疫荧光染色结果与上述结果一致。结论:STZ诱导的糖尿病模型小鼠有较典型的糖尿病临床改变,且肾组织发生了EMT。

A549细胞上皮-间质转分化中差异表达基因的生物信息学分析

[背景]在肺纤维化中,上皮-间质转分化(EMT)具有重要的作用。肺泡上皮细胞的EMT是肌成纤维细胞的一个重要来源。而随着高通量测序技术的发展,利用生物信息学的分析筛选EMT过程中的关键基因(Hub基因)引起了学者们的关注。[目的]分析人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549细胞)相关EMT过程中的差异表达基因,以此筛选肺纤维化相关EMT过程中的Hub基因以及相关的关键信号通路,以期为肺纤维化相关的EMT研究提供新的思路。[方法]从美国国立信息中心的基因表达综合数据库下载芯片数据集GSE17708,运用R语言中的limma包进行差异表达基因的分析。采用DAVID 6.8对差异表达基因进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析,并运用相互作用基因库检索工具数据库和Cytoscape软件绘制蛋白质-蛋白质相互作用网络。利用Cytoscape软件中的CytoHubba插件筛选Hub基因,最后通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术对A549细胞相关EMT过程中的Hub基因进行验证。[结果]基于高通量测序芯片的筛选,55个差异表达的基因主要参与的生物学途径包括胶原蛋白分解代谢的过程、细胞迁移正调控、生长负调节、内皮细胞凋亡过程的负调控以及细胞外基质组织;细胞组分的富集结果显示55个差异表达基因集中在胞外区和细胞外间隙;分子功能的富集显示差异表达基因主要具有细胞外基质结构组成、肝素结合、磷脂酰丝氨酸绑定、酶抑制剂的活动、纤连蛋白结合等功能。KEGG结果表明,差异表达基因可能参与细胞外基质受体相互作用、阿米巴类感染、黏着斑的形成、PI3K-Akt信号通路、矿物质吸收、血小板激活、补体及凝血级联反应、小细胞肺癌等信号通路。随后,通过最大团性中心方法筛选出得分最高的前8个基因(THBS1、COL4A1、COL5A1、COL4A2、FGG、SERPINE1、LAMC2、IGFBP5)作为EMT相关的Hub基因,qRT-PCR结果显示IGFBP5在A549细胞中的表达丰度较低,并且与对照组相比,TGF-β刺激A549细胞24 h和72 h的差异并不明显。除FGG在TGF-β刺激A549细胞24 h的时候表达情况与筛选结果不一致外,其他6个Hub基因表达情况与筛选结果一致。[结论]筛选出了7个与肺泡上皮细胞间质转分化相关的Hub基因,其中FGG表达下调,其他基因表达上调。

足细胞上皮-间充质转分化与肾小球疾病

目的足细胞对于维持肾小球滤过屏障的稳定性极为重要。足细胞的损伤可导致肾小球滤过功能障碍和相关肾脏疾病的发生。上皮-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是足细胞损伤的一种表现形式,也是多种肾小球疾病的始动因素之一。本文主要针对足细胞EMT的定义、具体表现、诱导因素、发生机制及相关肾小球疾病及其防治进行综述,以期阐明足细胞EMT最近研究进展,为相关肾脏疾病的治疗提供参考。

苦参素对肾间质纤维化大鼠肾小管上皮细胞-间质转分化的影响

目的探讨苦参素对肾间质纤维化大鼠肾小管上皮细胞-间质转分化的影响及可能机制。方法大鼠行单侧输尿管结扎(UUO)建立肾小管间质纤维化模型。实验分为假手术、UUO及苦参素治疗组。治疗组在UUO的基础上每天以苦参素100mg/kg腹腔注射。各组于术后第7、14、21天分别处死5只大鼠,分别检测大鼠血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)及24h尿蛋白定量。用PAS及Masson染色法观察肾脏病理改变。用免疫组织化学法观察转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及Ⅰ型胶原(ColⅠ)的表达。用RT-PCR法测定肾组织TGF-β1及α-SMA mRNA水平。结果与UUO组比较,苦参素治疗组肾脏TGF-β1、Smad3、α-SMA及ColⅠ的表达明显减少,肾小管损害和肾间质纤维化的程度也明显减轻。治疗组TGF-β1 mRNA及α-SMA mRNA表达显著低于对应时间点的UUO组。结论苦参素可下调TGF-β1、ColⅠ的表达,抑制肾小管上皮细胞转分化及肌成纤维细胞的活化与增殖,其作用途径可能是通过下调Smad3的表达,从而干预Smad3介导的细胞内信号转导,最终减轻肾间质纤维化。

博莱霉素诱导α平滑肌肌动蛋白Cre重组酶转基因小鼠肺纤维化上皮细胞-间质转分化的研究

目的探讨在博莱霉素诱导的肺纤维化中是否发生了上皮细胞-间质转分化(EMT)现象,支气管上皮细胞是否参与了这一过程。方法采用α平滑肌肌动蛋白Cre重组酶转基因小鼠(α-SMA-Cre/R26R双转基因鼠)为实验动物,构建博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型,进行组织X-gal染色和α平滑肌肌动蛋白免疫荧光检测。结果气管内灌注博莱霉素的转基因小鼠支气管上皮下部分X-gal蓝染明显增多,终末小气道周围和肺血管壁蓝染细胞出现或增多,部分地区出现了支气管周围肺泡上皮细胞(ACE)阳性蓝染和浸润。结论在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中可以观察到EMT现象,气道上皮细胞和肺泡上皮细胞能向间充质细胞转化,参与肺纤维化病理过程。