下一代测序法检测乙型肝炎病毒YMDD突变的方法学建立及性能评价

目的建立乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法,并对此方法进行性能评价。方法采用离心柱法提取血清标本中的DNA,设计引物对乙型肝炎病毒P基因区扩增并靶向捕获,通过下一代测序技术对捕获的DNA进行检测,利用生物信息学分析软件系统对检测结果进行分析,得到基因突变结果,建立下一代测序用于乙型肝炎病毒YMDD突变的检测方法。收集慢性乙型肝炎患者血清样本共229例,采用下一代测序法和Sanger测序法同时检测YMDD基因突变,评价下一代测序法的检测性能。选取5例基因突变阳性的样本(包含不同基因突变型别)、2例基因突变阴性样本,采用下一代测序法对所选样本进行重复检测,评价该方法的重复性。结果建立了乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序检测方法。对229份临床样本的检测中,2种测序方法均检测到74例(74/229,32.31%)YMDD突变,其中下一代测序法检测到44例(44/229,19.21%)rtM204V突变,25例(25/229,10.92%)rtM204I突变,5例(5/229,2.18%)rtM204V/I混合突变。Sanger测序法检测到47例(47/229,20.52%)rtM204V突变、25例(25/229,10.92%)rtM204I突变和2例(2/229,0.87%)rtM204V/I混合突变。下一代测序法检测到3例Sanger测序法漏检的rtM204V/I混合突变。与Sanger测序法相比,下一代测序法的灵敏度、特异度和准确度均为100%,突变类别完全符合率为95.95%(71/74),部分符合率为4.05%(3/74)。2种方法的一致性(κ)为0.97(P<0.01)。经重复性试验检测,下一代测序法的检测结果均一致,重复性符合率为100%。结论本研究建立的乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法灵敏度高,特异性好,重复性好,准确性高,比Sanger测序法更灵敏,能检测到更多的混合突变,为乙型肝炎病毒耐药基因检测提供了新的手段。

应用下一代测序技术进行HLA-A、HLA-B基因分型的模棱两可结果情况分析

目的统计分析NGS法进行HLA-A、HLA-B基因分型检测的模棱两可结果的种类、比例。方法对369例浙江省脐带血库标本采用NGS法检测HLA-A、HLA-B位点,并同步对其中94例标本采用PCR-SBT测序法测定HLA-A、HLA-B位点,余下275例标本采用PCR-SSO流式磁珠法检测。使用专业软件指定NGS法的HLA-A、HLA-B分型结果,直接计算法分析模棱两可组合比例。结果所有标本NGS法检测结果与PCR-SBT法或PCR-SSO法相符合,未发现NGS法遗漏等位基因情况。NGS法以HLA-A、HLA-B命名*后第四区域的数字作为高分辨水平统计,369例有34例标本出现模棱两可结果,占9.21%(34/369),其中只有2例标本HLA-A、HLA-B位点同时存在模棱两可结果。HLA-A位点有9例标本存在模棱两可结果,表现出8种类型;HLA-B位点有27例,25种类型,分别占标本总数的2.44%(9/369)、7.32%(27/369)。结论应用NGS技术仍有少量HLA-A、HLA-B基因分型的模棱两可组合结果。

果树MicroRNA检测技术研究进展

微RNA(MicroRNAs,miRNA)是一类广泛存在于真核生物中具有调控功能的内源性非编码RNA分子,miRNA表达谱系的差异与各种各样的生物调节途径有关。对目前果树miRNA研究中常见的检测方法——Northern blotting检测、ISH检测、miRNA芯片检测、测序检测和基于RT-PCR的检测做一简单介绍。

Xp21临近基因缺失综合征6例临床和遗传学研究

目的总结Xp21临近基因缺失综合征的临床表征和分子遗传学特点。方法回顾2012年7月至2015年1月首都医科大学附属北京儿童医院住院及门诊6例Xp21临近基因缺失综合征患儿临床表征、辅助检查结果,应用外显子捕获技术结合下一代高通量测序法(NGS)确定基因缺失的范围。结果 6例患儿均为男性,新生儿期即出现症状,由于受累区域基因缺失片段大小不同,致使以先天性肾上腺皮质功能不全、甘油尿症及杜氏型肌营养不良为典型表现的该综合征临床症候群也不尽相同。6例患儿均以进行性皮肤色素沉着起病,尿代谢筛查显示甘油显著升高,促肾上腺皮质激素显著升高,以及磷酸肌酸激酶显著升高。结论 NGS技术明确X染色体Xp21区域缺失范围,明确致病基因,为临床难以确诊的Xp21临近基因缺乏综合征提供了新的诊断思路和方法。