积雪草酸调节PI3K/AKT信号通路对七氟烷诱导的海马神经元HT-22细胞凋亡的影响

目的探讨积雪草酸(AA)通过调节磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路对七氟烷(SEVO)诱导的HT-22细胞凋亡的影响。方法使用不同浓度(0、5、10、15、20、30μmol/L)AA处理七氟烷诱导HT-22细胞24 h,CCK-8检测HT-22细胞活力;将HT-22细胞分为对照(Control)组、七氟烷(SEVO)组、AA低浓度(AA-L,10μmol/L)组、AA中浓度(AA-M,15μmol/L)组、AA高浓度(AA-H,20μmol/L)组和AA高浓度+PI13K通路抑制剂LY294002(AA-H+LY294002,20μmol/L AA+5μmol/L LY294002)组。显微镜下观察各组细胞形态变化,ELISA检测炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)及氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平,活性氧(ROS)试剂盒检测ROS水平,TUNEL试剂盒检测HT-22凋亡,JC-1法检测线粒体膜电位,三磷酸腺苷(ATP)含量检测试剂盒检测ATP含量,Western blot检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白表达。结果与0μmol/L相比,5~30μmol/L AA处理的HT-22细胞活力呈浓度依赖性升高(P<0.05),选择浓度为10、15、20μmol/L的AA用于后续实验。与SEVO组相比,AA-L组、AA-M组和AA-H组TNF-α、IL-6、MDA和ROS水平、细胞凋亡率、Bax和Caspase-3蛋白表达降低,SOD和GSH-Px水平、红/绿JC-1荧光比、ATP含量、Bcl-2蛋白表达、PI3K和AKT磷酸化水平增加(P<0.05),且呈浓度依赖性。LY294002可逆转AA对七氟烷诱导的HT-22细胞损伤的保护作用(P<0.05)。结论AA通过激活PI3K/AKT信号通路保护七氟烷诱导的HT-22细胞损伤,为新型减轻七氟烷诱导的神经毒性的药物开发提供了一定的理论参考。

LncRNA HOTAIR调节细胞自噬对脊髓损伤模型神经元凋亡的保护作用

目的:探讨长链非编码核糖核酸(LncRNA)HOX转录反义RNA(HOTAIR)在脊髓损伤凋亡和自噬中的作用及相关机制。方法:将雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)和模型组(SCI组)。构建缺氧缺糖诱导的SY-SH5Y细胞模型(OGD模型),将SY-SH5Y细胞分为Control组、OGD组、OGD+Vector组、OGD+pcDNA-HOTAIR组、OGD+pcDNA-HOTAIR+NC mimic组、OGD+pcDNA-HOTAIR+miR-17 mimic组。通过脊髓损伤运动功能(BBB)评分评估大鼠运动功能的恢复能力;通过双荧光素酶报告基因实验分别检测HOTAIR和miR-17、miR-17和Beclin-1之间的靶向关系;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测大鼠脊髓组织和细胞中HOTAIR、miR-17、Beclin-1 mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测大鼠脊髓组织和细胞中Beclin-1、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、P62蛋白的表达;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果:与Sham组比较,SCI组大鼠BBB评分下降,脊髓组织中HOTAIR水平降低,miR-17水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Control组比较,OGD组处理的SY-SH5Y细胞中HOTAIR水平降低,miR-17水平升高,神经元凋亡率升高,LC3Ⅱ蛋白表达降低,P62蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与OGD+Vector组比较,OGD+pcDNA-HOTAIR组细胞中HOTAIR水平升高(P<0.05),神经元凋亡率降低(P<0.05),LC3Ⅱ蛋白表达升高(P<0.05),P62蛋白表达降低(P<0.05),而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)逆转了这一结果(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,Beclin-1是miR-17的靶基因,miR-17是HOTAIR的靶基因。与OGD+pcDNA-HOTAIR+NC mimic组比较,OGD+pcDNA-HOTAIR+miR-17 mimic组细胞中miR-17表达明显升高,神经元凋亡率明显升高,Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表达降低,P62蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:LncRNA HOTAIR通过靶向miR-17/Beclin-1通路增强自噬,从而减轻神经元凋亡和改善脊髓损伤。

苁蓉散通过抑制内质网应激减少AD模型大鼠海马神经元细胞凋亡

目的:探究苁蓉散(Cong Rong San,CRS)对阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)模型大鼠神经元损伤及内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的影响。方法:将60只SD雄性大鼠(2月龄)随机分为对照组、模型组、低剂量CRS组、中剂量CRS组、高剂量CRS组和盐酸美金刚组。Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力;HE和尼氏染色观察大鼠海马CA1区的神经元形态;透射电镜观察大鼠海马的内质网形态;TUNEL染色观察大鼠海马CA1区神经元的凋亡情况;Western blot实验检测大鼠海马中葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bcl-2-ssociated X protein,Bax)、caspase-3及通路蛋白蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、p-PERK、激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达。结果:与模型组比较,中、高剂量的CRS能有效提高大鼠学习记忆能力,减少神经元的丢失,抑制ERS通路PERK-ATF4-CHOP的发生,减少海马中凋亡蛋白Bax和caspase-3的表达,增加海马中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论:CRS可以减轻AD大鼠认知损伤、海马神经元的损伤和神经元凋亡,其机制可能是抑制了ERS。

基于JNK通路探讨调更汤对GT1-7下丘脑神经元细胞凋亡的保护作用

目的:研究调更汤通过c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路改善下丘脑神经元细胞凋亡的作用机制。方法:采用下丘脑神经元细胞GT1-7细胞株,以三丁基氯化锡(TBTC)诱导模拟神经元细胞凋亡模型作为模型组(1 mg·L-1),以17β-雌二醇(17β-E2)为阳性药物作为17β-E2组(100 nmol·L-1),调更汤低、中、高剂量组(31. 25,62. 5,125 mg·L-1)进行干预。以倒置荧光显微镜观察细胞形态学变化;细胞增殖毒性(CCK-8)法检测细胞活力;Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核的形态改变;Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染色法检测下丘脑神经元细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测JNK通路凋亡相关蛋白凋亡信号调节激酶1(ASK1),JNK,p53,活化半胱氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3)表达水平及JNK抑制剂SP600125干预后磷酸化JNK(p-JNK),cleaved Caspase-3的蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组细胞活力显著降低(P <0. 01),细胞凋亡率显著升高(P <0. 01),JNK通路相关蛋白磷酸化ASK1(p-ASK1),p-JNK,磷酸化p53(p-p53),cleaved Caspase-3的表达显著增加(P <0. 01)。与模型组比较,调更汤显著改善GT1-7细胞活力(P <0. 01),降低细胞凋亡率(P <0. 01),调节p-ASK1,p-JNK,p-p53,cleaved Caspase-3蛋白的表达;高剂量调更汤联合应用SP600125(10μmol·L-1)处理后,更显著的抑制GT1-7细胞p-JNK,cleaved Caspase-3的蛋白表达(P <0. 01)。结论:调更汤通过JNK通路改善下丘脑神经元细胞凋亡,为调更汤治疗绝经综合征和中枢神经保护作用提供理论依据。

牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡

背景:牛磺熊去氧胆酸是一种亲水性胆汁酸衍生物,在多种神经系统疾病模型中均有神经保护作用,但目前鲜有报道研究牛磺熊去氧胆酸对脊髓损伤的作用。目的:观察缺糖缺氧条件下牛磺熊去氧胆酸对脊髓神经元凋亡的作用,以及对脊髓损伤后小鼠运动功能恢复的影响。方法:①体外实验:从孕13.5 d的C57 BL/6小鼠胚胎中分离提取原代脊髓神经元,培养72 h后,分3组处理:正常组加入Neurobasal完全培养基,置于CO_(2)培养箱(体积分数5%CO_(2)+95%空气)内培养24 h;氧糖剥夺组加入无糖的Neurobasal培养基,置于三气培养箱(体积分数94%N2+5%CO_(2)+1%O_(2))培养12 h,更换为Neurobasal完全培养基后置于CO_(2)培养箱内培养12 h;实验组处理过程大致同氧糖剥夺组,其中在加入无糖Neurobasal培养基的同时加入牛磺熊去氧胆酸。采用TUNEL染色检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞活性,免疫荧光染色检测细胞βⅢ微管蛋白表达。②动物实验:采用随机数字表法将60只C57 BL/6小鼠分为假手术组、脊髓损伤组与实验组,每组20只,脊髓损伤组与实验组采用Allen打击法建立T_(9)-T_(10)脊髓损伤模型,造模后第1天开始,实验组灌胃给予牛磺熊去氧胆酸溶液,假手术组与脊髓损伤组灌胃给予生理盐水,1次/d。连续给药14 d后,采用行为学和组织学方法评估脊髓组织修复情况。结果与结论:①体外实验:TUNEL染色、CCK-8与免疫荧光染色检测显示,氧糖剥夺组细胞凋亡数量高于正常组(P<0.01),细胞活性与βⅢ微管蛋白表达低于正常组(P<0.01);实验组细胞凋亡数量低于氧糖剥夺组(P<0.01),细胞活性与βⅢ微管蛋白表达高于氧糖剥夺组(P<0.01)。②动物实验:旷场实验BBB评分与后肢足迹实验显示,实验组小鼠行走与运动功能恢复程度好于脊髓损伤组。苏木精-伊红染色显示,脊髓损伤组小鼠脊髓损伤部位可见明显畸形和空洞,神经细胞数量明显减少;与脊髓损伤组比较,实验组脊髓损伤病变面积显著减小,脊髓畸形程度更小、空洞更少,神经细胞数量增加。免疫荧光染色显示,脊髓损伤组神经元胞核标记神经元细胞数量少于假手术组(P<0.01),实验组神经元胞核标记神经元细胞数量高于脊髓损伤组(P<0.01)。③结果表明:牛磺熊去氧胆酸能减少缺糖缺氧引起的脊髓神经元凋亡、轴突的丢失,促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复。

右美托咪定对癫痫大鼠海马神经元细胞凋亡与Toll样受体4/核因子κB信号通路的影响

目的:探讨右美托咪定对癫痫大鼠海马神经元细胞凋亡和Toll样受体4(TLR-4)/核因子κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:选择45只健康SD大鼠随机分为A组、B组和C组,各15只。适应饲养1周后给予C组大鼠腹腔注射20μg/kg右美托咪定,给予A组和B组大鼠腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液,均连续腹腔注射7 d。随后B组和C组采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射制作大鼠癫痫模型,A组大鼠不做处理。造模成功1周后进行Morris水迷宫测试。处死大鼠取脑组织,采用TUNEL技术检测海马组织神经元凋亡比例,采用酶联免疫吸附法检测海马组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)水平,采用Western blot技术检测海马组织中NF-κB、磷酸化NF-κB(pNF-κB)、离子钙结合衔接分子1(Iba-1)、TLR-4相对表达水平。结果:C组各时间点逃避潜伏期显著长于A组,但显著短于B组(均P<0.05);C组大鼠平台穿越次数显著少于A组,多于B组(均P<0.05)。B组和C组大鼠海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著高于A组,C组大鼠各指标显著低于B组(均P<0.05)。C组大鼠海马神经元凋亡比例显著高于A组,但显著低于B组(均P<0.05)。C组大鼠海马组织pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相对表达水平显著高于A组,但显著低于B组(均P<0.05)。结论:右美托咪定不仅可以通过激活TLR-4/NF-κB信号通路抑制癫痫大鼠海马神经元的炎性反应,还可以通过激活TLR-4/NF-κB信号通路下调炎症因子进而抑制癫痫大鼠海马神经元细胞的凋亡,从而改善神经功能,发挥神经保护作用。

非编码RNA调控脊髓损伤后神经元细胞凋亡的作用和机制

背景:脊髓损伤后神经元细胞凋亡是造成脊髓永久性损伤的一个主要原因,探索防止脊髓损伤后神经元凋亡的方法意义重大。现有的动物实验研究表明,非编码RNA能够对脊髓损伤后神经元细胞凋亡进行调控,这或许可以给临床脊髓损伤后神经元保护性治疗提供一定参考。目的:对非编码RNA调控脊髓损伤后神经元凋亡作用和机制进行综述,为脊髓损伤的保护性治疗提供新的靶点。方法:以“microRNA,miR,lncRNA,circRNA,noncoding RNA,RNA,SCI,spinal cord injury,spinal cord,apoptosis”为检索词在PubMed数据库中进行检索,制定纳排标准,通过阅读文题、摘要和全文进行筛选,最终纳入87篇相关文献。结果与结论:(1)神经元细胞凋亡为继发性脊髓损伤中极其重要的病理生理改变,是神经元死亡、脊髓功能障碍的重要致病机制之一。(2)动物实验研究发现,在脊髓损伤后的脊髓组织中,与神经元细胞凋亡相关的miRNA、长链非编码RNA(lncRNA)与环状RNA(circRNA)可出现差异性表达,一些促进神经元凋亡的miRNA,lncRNA与circRNA过表达,而另一部分抑制神经元凋亡的miRNA、lncRNA与circRNA表达下调。(3)调控特定miRNA的相应表达,主要通过靶向下调凋亡基因Bax、抑制TLR4/核转录因子κB信号通路、激活PI3K/Akt信号通路等方式可抑制脊髓损伤后神经元细胞过度凋亡。(4)调控lncRNA和circRNA的表达,主要通过靶向负调控的方式使得特定miRNA出现沉默或过表达,从而发挥其抗神经元细胞凋亡的作用。(5)在miRNA中,miR-125b对Smurf1/KLF2/ATF2轴及JAK1/STAT1信号通路等均可产生调节,而miR-21-5p对程序性细胞死亡因子4(PDCD4)和PI3K/AKT信号通路等可产生调节,具有多途径抗凋亡的作用。(6)在lncRNA和circRNA中,lncRNA-PTENP1,lncRNA-TCTN2和circRNA-HIPK3均对于多种miRNA具有靶向调节作用,这些非编码RNA也许可以成为脊髓损伤后神经元保护性治疗的新靶点。(7)目前对于非编码RNA调控脊髓损伤后神经元细胞凋亡还仅停留在动物及细胞研究层面,未来需要继续探索更加具有靶向作用的非编码RNA药物载体,联合生物组织工程以及其他新兴技术,争取早日向临床转化过渡。

高龄孕鼠子代脑海马星形胶质细胞和神经元初级纤毛功能缺陷可能与LKB1/AMPK通路促进凋亡相关

目的探讨高龄妊娠子代脑海马星形胶质细胞和神经元初级纤毛与凋亡的变化情况以及LKB1/AMPK通路在其中的作用。方法采用12月龄SD雌鼠与3月龄SD雄鼠交配产下子代作为高龄(advanced maternal age,AMA)组,3月龄SD雌鼠与3月龄SD雄鼠交配产下子代作为适龄(control,Ctl)组,于生后第14、28、60天(P14、P28、P60)对两组(各时间点每组14只,均雌雄各半)进行下列研究:苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和尼氏染色观察海马神经元形态、数量及其内部尼氏体的变化;免疫荧光检测海马初级纤毛标志物抗ADP核糖基化因子相似蛋白-13B(anti-ADP-ribosylation factor-like protein 13B,ARL13B)表达,Western blot检测海马鞭毛内运输蛋白88(intraflagellar transport 88,IFT88)表达,评估初级纤毛发生功能变化;TUNEL染色及Western blot检测促凋亡基因Bax表达蛋白(BAX)、抑凋亡基因Bcl-2表达蛋白(BCL-2)水平,观察海马内细胞凋亡变化;Western blot检测肝脏激酶B1(liver kinase B1,LKB1)、单磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)及其对应的磷酸化蛋白表达水平,评估LKB1/AMPK通路变化。结果与Ctl组相比:HE染色、尼氏染色结果显示,AMA组在P14时海马神经元数量明显减少(P<0.05),AMA组在各时间点海马神经元形态和尼氏体数量、形态均存在异常变化;AMA组ARL13B阳性细胞发生率在P14(P<0.05)和P28(P<0.001)时均显著下降,ARL13B长度在P14和P28显著缩短(P均<0.05),同时,AMA组IFT88蛋白表达在P14时明显下降(P<0.01);TUNEL染色发现AMA组在P14时海马内细胞凋亡率明显增高(P<0.05);Western blot结果显示AMA组在P14时BAX蛋白表达显著升高(P<0.001),BCL-2蛋白表达显著降低(P<0.01);AMA组在P14时磷酸化LKB1表达明显下降(P<0.05),磷酸化AMPK表达水平在P28和P60时明显升高(P均<0.01),磷酸化mTOR表达在P60时明显下降(P<0.05)。结论高龄妊娠子代幼年期脑海马存在神经元损伤、初级纤毛发生缺陷和生长功能抑制,以及凋亡异常激活,同时高龄妊娠子代脑海马星形胶质细胞和神经元初级纤毛调控的LKB1/AMPK通路在各年龄期均存在异常活化。

姜酮通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻OGD/R后氧化应激损伤对HT22细胞凋亡的抑制作用

目的:探讨姜酮对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)后小鼠海马神经元HT22细胞的保护作用,阐明其相关作用机制。方法:培养HT22细胞,设置不同OGD/R时间梯度,建立OGD/R细胞损伤模型。HT22细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+1μmol·L^(-1)姜酮组、OGD/R+10μmol·L^(-1)姜酮、OGD/R+100μmol·L^(-1)姜酮组和OGD/R+0.2%二甲亚枫(DMSO)组,CCK-8法检测各组细胞活性并计算各组细胞存活率,确定姜酮最适药物浓度。细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+姜酮组和OGD/R+姜酮+核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂(ML385)组,OGD/R+姜酮组细胞经姜酮给药处理4 h后予以OGD 8 h和复糖复氧8 h处理,OGD/R+姜酮+ML385组细胞在姜酮给药前予以10μmol·L^(-1)ML385预处理6 h,CCK-8法检测各组细胞活性,Western blotting法检测各组细胞中Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组细胞培养上清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平。结果:与对照组比较,HT22细胞经OGD 8 h和复糖复糖8 h处理后细胞存活率低于50%,以OGD 8 h和复糖复糖8 h建立HT22细胞OGD/R模型。与OGD/R组比较,OGD/R+不同剂量姜酮组细胞存活率均不同程度升高,其中OGD/R+100μmol·L^(-1)姜酮组细胞存活率升高最明显(P<0.01),故选用100μmol·L^(-1)姜酮用于后续实验。与对照组比较,OGD/R组细胞活性明显降低(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞培养上清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.01);与OGD/R组比较,OGD/R+姜酮组细胞活性明显升高(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01),Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞培养上清中SOD活性明显升高(P<0.01),MDA水平明显降低(P<0.01);与OGD/R+姜酮组比较,OGD/R+姜酮+ML385组细胞活性明显降低(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),细胞培养上清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.05)。结论:姜酮可通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻OGD/R后氧化应激损伤对HT22细胞凋亡的抑制作用。

咪达唑仑调控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路对缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨咪达唑仑对缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖、凋亡的影响及其对miR-214/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)-环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)通路的调控作用。方法采用缺氧复氧诱导大鼠海马神经元细胞建立细胞损伤模型(缺氧复氧组),加入不同剂量的咪达唑仑处理细胞(3、6、12μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧组);实验分组:NC组(未经处理的大鼠海马神经元细胞)、12μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-con组(anti-miR-con转染入大鼠海马神经元细胞后加入12μmol/ml咪达唑仑处理24 h后进行缺氧复氧处理)、12μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组(anti-miR-214转染入大鼠海马神经元细胞后加入12μmol/ml咪达唑仑处理24 h后进行缺氧复氧处理)、PD98059+12μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组(anti-miR-214转染入大鼠海马神经元细胞后加入12μmol/ml咪达唑仑与50μmol/L抑制剂PD98059处理24 h后进行缺氧复氧处理);采用噻唑蓝(MTT)实验检测细胞活力;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;采用实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)检测miR-214的表达量;采用Western印迹检测MAPK、p-ERK、p-CREB、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达量。结果与NC组比较,缺氧复氧组细胞活力明显降低,Bcl-2蛋白水平与miR-214的表达水平明显降低,凋亡率与Bax、MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平升高(P<0.05);与缺氧复氧组比较,咪达唑仑不同剂量组细胞活力明显升高,Bcl-2蛋白水平与miR-214的表达水平明显升高,凋亡率与Bax、MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明显降低(P<0.05);与12μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-con组比较,12μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组细胞活力与Bcl-2蛋白水平明显降低,凋亡率与Bax、MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明显升高(P<0.05);与12μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组比较,PD98059+12μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组细胞活力与Bcl-2蛋白水平明显升高,凋亡率与MAPK、p-ERK、p-CREB、Bax蛋白水平明显降低(P<0.05)。结论咪达唑仑可通过上调miR-214的表达而抑制MAPK/ERK-CREB通路的活化从而促进缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖及抑制细胞凋亡。

miR-126-5p通过靶向TRAF3抑制糖氧剥夺再灌注介导的HT22细胞凋亡和炎症

目的探讨miR-126-5p通过靶向肿瘤坏死因子受体相关因子3(tumor necrosis factor receptor-associated factor 3,TRAF3)对糖氧剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)介导的小鼠海马神经元细胞HT22细胞凋亡和炎症的影响。方法模拟缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)损伤在体外建立氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)细胞模型,分析miR-126-5p与TRAF3靶向关系及对HT22细胞凋亡和炎症反应的影响。结果与对照组比较,OGD/R组中miR-126-5p下调而TRAF3 mRNA及蛋白水平上调,细胞存活率及Bcl-2蛋白水平降低,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量、细胞凋亡率、Bax及Cleaved caspase-3蛋白水平升高(P均<0.05)。与OGD/R+mimic-NC组比较,OGD/R+miR-mimic组、OGD+miR-mimic+pcDNA组TRAF3蛋白水平、LDH释放量、细胞凋亡率、Bax及Cleaved caspase-3蛋白水平明显降低,细胞存活率及Bcl-2蛋白水平升高,而OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3组各指标升高,细胞存活率明显下降(P均<0.05)。结论miR-126-5p通过靶向TRAF3,抑制OGD/R介导的HT22细胞凋亡和炎症反应,从而对神经元细胞发挥保护作用。

脊髓损伤对下丘脑c-Fos表达及神经细胞凋亡的影响

目的探讨脊髓损伤后下丘脑神经细胞凋亡情况,确认脊髓损伤导致大脑损害的特点及其在相关并发症发生发展中的可能机制。方法18只SD大鼠随机分为两组:假模组(Sham组)和脊髓损伤组(SCI组),以改良的Allen’s撞击法制作脊髓损伤动物模型,常规饲养,分别于8周取大鼠下丘脑组织,应用免疫荧光染色法观察脊髓损伤大鼠下丘脑组织c-Fos表达,TUNEL法观察两组下丘脑神经细胞凋亡情况,应用ELISA法检测两组大鼠下丘脑炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)表达。结果脊髓损伤后8周,SCI组较Sham组下丘脑c-Fos表达明显增加(P<0.05),同时下丘脑可见明显凋亡细胞,主要表现为胞浆减少,细胞核深染、固缩在一边;SCI组TUNEL阳性细胞数比Sham组明显增多,差异有统计学意义(P<0.01);SCI组大鼠下丘脑包括TNF-α、IL-1β、IL-6等多种炎症因子水平较Sham组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论脊髓损伤可对下丘脑造成损害,表现为下丘脑神经细胞凋亡及炎症反应明显增加,其可能与c-Fos表达有关,脊髓损伤后对下丘脑的损害可能是某些并发症发生发展的发病机制。

三丁基氯化锡诱导下丘脑神经元细胞凋亡的模型研究

目的:建立三丁基氯化锡(TBTC)诱导的新生雌性大鼠下丘脑神经元细胞凋亡模型,并探讨相关机制。方法:取新生24 h以内的雌性SD大鼠,分离下丘脑神经元细胞进行原代培养。免疫荧光染色法鉴定下丘脑神经元纯度后,分别暴露于含不同浓度TBTC(0、100、150、200、250、300μg/L)的培养基中。孵育24 h后,CCK-8检测各组细胞存活率,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核形态,透射电镜观察细胞形态的改变,Western blot检测凋亡相关蛋白JNK、p-JNK的表达。结果:免疫荧光染色鉴定神经元纯度约为92.23%。与TBTC 0μg/L组相比,各浓度TBTC干预24 h对下丘脑神经元细胞的生长均有抑制作用,其相对存活率均显著降低(P<0.01),且呈浓度依赖性;与TBTC 0μg/L组相比,不同浓度的TBTC作用24 h后,下丘脑神经元细胞均出现不同程度的细胞凋亡,其细胞凋亡率均显著升高(P<0.01),且呈浓度依赖性。Hoechst 33258染色显示,TBTC 150μg/L组下丘脑神经元细胞核呈致密浓染的高强度蓝色荧光,细胞核出现明显的凋亡形态。透射电镜观察显示,TBTC 150μg/L组出现细胞核固缩并发生裂解,染色质边集化,可见多个凋亡小体;与TBTC 0μg/L组相比,TBTC 150μg/L组细胞p-JNK蛋白表达显著增多,p-JNK/JNK蛋白表达比值显著上调(P<0.01)。结论:TBTC 150μg/L干预24 h可诱导下丘脑神经元细胞凋亡,其损伤机制与上调p-JNK蛋白表达有关。

利拉鲁肽和有氧运动对肥胖大鼠下丘脑弓状核神经元凋亡的影响（英文）

目的:探讨利拉鲁肽和有氧运动对肥胖大鼠下丘脑弓状核(ARC)神经元形态学及细胞凋亡的影响。方法:高脂饮食建立肥胖大鼠模型,并随机分为高脂饮食+生理盐水组(HS组)、高脂饮食+利拉鲁肽组(HL组)、高脂饮食+有氧运动组(HE组);基础饲料喂养作为对照组(NC组)。HL组予皮下注射利拉鲁肽200μg/(kg·d),NC组和HS组均予皮下注射等量生理盐水,HE组进行无负重游泳训练,60 min/d。干预6周后,采用尼式染色观察下丘脑ARC神经元形态结构,免疫荧光染色法检测Bax、Bcl-2表达水平,TUNEL法检测神经细胞凋亡率。结果:尼式染色结果显示,NC组下丘脑弓状核区神经元结构完整,排列紧密;HS组下丘脑ARC神经元显著减少,排列紊乱,可见核固缩等明显改变;HL组和HE组神经细胞均有改善。与NC组相比,HS组细胞凋亡率和Bax表达显著增高,Bcl-2表达显著降低(均P<0.01)。利拉鲁肽或有氧运动可降低TUNEL阳性细胞数和Bax表达,同时上调Bcl-2表达(均P<0.01),且HL组改善效果更明显。结论:利拉鲁肽可明显改善下丘脑ARC神经元形态结构,抑制肥胖大鼠神经元凋亡,且效果优于有氧运动。

外源性八肽胆囊收缩素对谷氨酸诱导大鼠大脑皮层神经元凋亡的保护作用研究

目的探讨外源性八肽胆囊收缩素(CCK-8)对谷氨酸诱导体外大鼠大脑皮层神经元损伤模型中神经细胞凋亡的保护作用及其可能作用机制。方法不同浓度CCK-8处理体外培养的大鼠大脑皮层神经元,MTT法检测细胞存活情况并筛选合适浓度。培养大鼠大脑皮层神经细胞并用谷氨酸(Glu)处理建立神经元损伤模型,分为模型组、CCK-8组,另设对照组。采用流式细胞术检测细胞周期与凋亡率;Flou-4实验检测各组细胞Ca^(2+)水平;实时定量PCR法检测B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)mRNA表达情况;Western blot检测Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达情况。结果与对照组比较,模型组神经元细胞存活率、G_(1)期细胞分布比例、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平降低,S期、G_(2)/M期细胞分布比例、细胞凋亡率、Ca^(2+)水平、Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)。与模型组比较,CCK-8组神经元细胞存活率、G_(1)期细胞分布比例、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平升高,S期、G_(2)/M期细胞分布比例、细胞凋亡率、Ca^(2+)水平、Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论CCK-8对谷氨酸诱导的神经元细胞凋亡有一定的抑制作用,可能是通过抑制钙离子内流,调节细胞内Bax/Bcl-2表达水平发挥作用。

LINC00657对氧糖剥夺诱导的小鼠海马神经元细胞损伤的影响及机制研究

目的探讨LINC00657对氧糖剥夺(OGD)诱导的小鼠海马神经元细胞损伤的影响及作用机制。方法对小鼠海马神经元细胞HT22进行OGD处理,建立损伤模型,将正常培养的HT22细胞作为对照;将si-NC、si-LINC00657、微小RNA(miR)-NC、miR-224-3p mimics分别转染至HT22细胞,然后进行OGD处理;向HT22细胞共转染si-LINC00657和anti-miR-NC,或共转染si-LINC00657和anti-miR-224-3p,然后进行OGD处理。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LINC00657、miR-224-3p相对表达量;采用CCK-8法、流式细胞术分别检测细胞存活率、细胞凋亡率;采用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)水平;采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-224-3p过表达对野生型LINC00657载体(WT-LINC00657)、突变型LINC00657载体(MUT-LINC00657)荧光素酶活性的影响。结果与对照细胞相比,OGD诱导的HT22细胞中LINC00657表达上调,miR-224-3p表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);分别与转染si-NC或转染miR-NC相比,转染si-LINC00657或转染miR-224-3p mimics后,细胞存活率、SOD活性和GSH-Px活性升高,细胞凋亡率、LDH活性和MDA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);miR-224-3p过表达降低了WT-LINC00657的荧光素酶活性,差异有统计学意义(P<0.05);与共转染si-LINC00657和anti-miR-NC的细胞相比,共转染si-LINC00657和anti-miR-224-3p的细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,LDH活性、MDA水平升高,SOD、GSH-Px活性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论干扰LINC00657可通过上调miR-224-3p而促进细胞增殖,并抑制细胞凋亡和氧化应激反应,从而减轻OGD诱导的小鼠海马神经元细胞损伤。

血红素氧合酶1促进氧化应激条件下神经干细胞向神经元分化

背景:研究表明,血红素氧合酶1能增强细胞的抗氧化、抗凋亡能力,但血红素氧合酶1过表达对氧化应激条件下神经干细胞增殖和分化的影响尚不清楚。目的:探讨血红素氧合酶1过表达对氧化应激条件下神经干细胞存活和分化能力的影响。方法:(1)从新生Balb/c小鼠脊髓组织中分离培养小鼠原代神经干细胞,免疫荧光检测神经干细胞标志物Nestin的表达;(2)采用慢病毒感染神经干细胞以诱导血红素氧合酶1过表达,流式检测绿色荧光蛋白荧光强度,Western blot检测血红素氧合酶1的表达水平;(3)在慢病毒感染神经干细胞培养基中添加H_2O_2以模拟脊髓损伤后的氧化应激微环境,采用细胞增殖检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒和TUNEL染色试剂盒分析血红素氧合酶1过表达对神经干细胞增殖和凋亡水平的影响;(4)采用试剂盒检测脂质氧化标志物丙二醛、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平;(5)采用流式检测细胞内的活性氧水平以及神经干细胞向星形胶质细胞和神经元分化情况;(6)光学和荧光显微镜观察血红素氧合酶1过表达对神经干细胞分化的神经元轴突生长的影响。结果与结论:(1)小鼠神经干细胞球形态稳定,生长状态良好,免疫荧光检测Nestin呈阳性;(2)Western blot检测发现血红素氧合酶1过表达组神经干细胞中血红素氧合酶1的表达显著高于空载体对照组;流式检测血红素氧合酶1过表达组和空载体对照组神经干细胞均表达绿色荧光蛋白;(3)血红素氧合酶1过表达维持了神经干细胞在氧化应激条件下的增殖活力并显著减少了细胞凋亡数量;(4)血红素氧合酶1过表达抑制了氧化应激微环境下神经干细胞的脂质过氧化,增强了维持氧化-还原稳态的相关酶类表达,降低了细胞内的活性氧水平;(5)血红素氧合酶1过表达促进了神经干细胞向神经元分化,并抑制了向星形胶质细胞分化;(6)血红素氧合酶1过表达组的神经元轴突更长并且细胞间的连接更多。上述结果表明过表达血红素氧合酶1能减轻H_2O_2诱导的神经干细胞氧化损伤,抑制神经干细胞凋亡,促进神经干细胞增殖及向神经元细胞分化。

盐酸羟考酮对癫痫大鼠炎症和神经元凋亡的影响及机制研究

目的探究盐酸羟考酮通过c-Jun氨基末端激酶(JNK)/p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路对癫痫大鼠炎症和神经元凋亡的影响。方法构建癫痫大鼠模型,将造模成功的72只癫痫大鼠随机分为模型组、低剂量组(盐酸羟考酮0.125mg/kg)、中剂量组(盐酸羟考酮0.25mg/kg)、高剂量组(盐酸羟考酮0.5mg/kg)、茴香霉素组(茴香霉素5mg/kg)、联合组(盐酸羟考酮0.5mg/kg+茴香霉素5mg/kg),每组12只。另取12只健康大鼠作为对照组。给药结束24h后,记录各组大鼠癫痫发作频率和持续时间;酶联免疫吸附法检测血清TNF-α、白介素细胞6(IL-6)水平;苏木精-伊红染色观察海马CA1区组织病理学变化;TUNEL染色观察海马CA1区组织神经元凋亡状况;蛋白印迹法检测海马CA1区组织JNK、磷酸化JNK、p38MAPK、磷酸化p38MAPK和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠癫痫发作频率、持续时间、血清TNF-α、IL-6水平、海马CA1区组织神经元凋亡率、磷酸化JNK/JNK比值、磷酸化p38 MAPK/p38 MAPK比值、Caspase-3表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠癫痫发作频率、持续时间、血清TNF-α、IL-6水平、海马CA1区组织神经元凋亡率、磷酸化JNK/JNK比值、磷酸化p38MAPK/p38MAPK比值、Caspase-3表达依次降低,茴香霉素组大鼠癫痫发作频率、持续时间、血清TNF-α、IL-6水平、海马CA1区组织神经元凋亡率、磷酸化JNK/JNK比值、磷酸化p38MAPK/p38MAPK比值、Caspase-3表达明显升高(P<0.05);联合组大鼠癫痫发作频率、持续时间、血清TNF-α、IL-6水平、海马CA1区组织神经元凋亡率明显高于高剂量组,明显低于茴香霉素组(P<0.05)。联合组大鼠海马CA1区组织磷酸化JNK/JNK比值、磷酸化p38 MAPK/p38 MAPK比值、Caspase-3表达明显高于高剂量组,明显低于茴香霉素组(0.89±0.12vs0.25±0.05vs1.08±0.16,0.81±0.08vs 0.21±0.04vs0.94±0.12,0.79±0.12vs0.26±0.04vs0.89±0.14,P<0.05)。结论盐酸羟考酮可降低癫痫大鼠炎性反应,改善大鼠癫痫症状和病理损伤,保护神经元,其机制与抑制JNK/p38MAPK信号通路有关。

蒺藜皂苷对缺氧/复氧诱导大鼠皮层神经元凋亡及细胞内钙变化的作用

目的:观察蒺藜皂苷(TTLS)对缺氧/复氧诱导的大鼠皮层神经元凋亡及细胞内游离钙离子浓度变化的影响。方法:原代培养大鼠皮层神经元,建立缺氧/复氧损伤的皮层神经元凋亡模型。比色法测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放漏出率;AnnexinV-FITC/PI双染,流式细胞仪定量分析细胞凋亡百分率;Fluo-3荧光染色,激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内钙平均荧光值变化。结果:缺氧3h复氧12h可诱导出皮层神经元凋亡,引起细胞内钙离子浓度增高,高于对照组(P<0.01)。蒺藜皂苷(0.025g/L)能明显降低缺氧/复氧诱导的神经元凋亡,并可降低细胞内钙浓度,与模型组比较有显著差异(P<0.01)。结论:蒺藜皂苷可降低由缺氧/复氧诱导的皮层神经元的凋亡,减轻细胞损伤,这种作用机制可能与其抑制神经细胞内钙超载有关。

大鼠脑缺血再灌注后神经元和星形胶质细胞凋亡的比较研究

目的比较研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经元和星形胶质细胞的凋亡规律。方法建立大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,在缺血再灌注后1、3、7、14d断头取脑,应用流式细胞分选技术和原位末端标记法分别检测各组MCAO后不同时期神经元和星形胶质细胞凋亡情况。结果局灶性脑缺血再灌注后,海马区星形胶质细胞凋亡数量超过神经元,其凋亡以再灌注3d最为显著,而神经元则以7d最为显著;而皮层区神经元凋亡数量超过星形胶质细胞,两种细胞凋亡均在再灌注后7d达高峰。结论脑缺血再灌注后,皮层和海马区的神经元及星形胶质细胞均可发生凋亡,海马区星形胶质细胞比皮层区更易凋亡,而皮层区神经元比海马区更易凋亡。