Kiss-1基因在猪初情期下丘脑-垂体-卵巢轴中的定位研究

[目的]为阐明猪的生殖机理和选育早熟品种奠定基础。[方法]采用免疫组化技术研究Kiss-1 mRNA在初生以及30、60、70(初情期)和90日龄小梅山猪的下丘脑、卵巢和垂体内的定位,并利用放射免疫分析(RIA)方法观察母猪血浆LH、FSH含量的变化。[结果]Kiss-1 mRNA在小梅山猪下丘脑、卵巢、垂体中均有表达,以下丘脑弓状核阳性颗粒最多,尤其初情期时最为明显。各级卵泡中以初情期成熟卵泡的阳性颗粒数目最多。Kis-s1 mRNA表达量在小梅山猪下丘脑、垂体和卵巢从初生到初情期逐渐上升,并在初情期达到顶峰,而后逐渐下降。小梅山猪血浆LH、FSH浓度初生时较高,随后迅速下降,60日龄又升高,70日龄达到峰值。

初情期母牦牛下丘脑kiss-1/GPR54系统基因克隆

应用聚合酶链反应和基因克隆技术,对10头初情期母牦牛下丘脑kiss-1/GPR54系统基因进行扩增和基因克隆。结果表明,kiss-1基因拼接后序列全长为291bp,其中CDS序列长为282bp,序列中碱基组分为腺嘌呤20.62%,鸟嘌呤27.14%,胸腺嘧啶23.37%,胞嘧啶28.87%。共编码95个氨基酸,其中丙氨酸占总氨基酸残基的11.58%,亮氨酸占10.52%,丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸各占9.47%。GPR54基因拼接后序列全长为202bp,其中CDS序列长为196bp,序列中碱基组分为腺嘌呤16.34%,鸟嘌呤30.69%,胸腺嘧啶17.82%,胞嘧啶35.15%。GPR54基因共编码66个氨基酸,其中脯氨酸占总氨基酸残基的13.63%,甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸各占10.60%,半胱氨酸占9.09%。

初情期启动过程中小尾寒羊下丘脑KiSS-1基因甲基化状态与表达量相互关系

KiSS-1基因在雌性动物初情期启动中扮演着重要作用,其启动子区甲基化状态与KiSS-1mRNA表达量之间关系尚不清楚。本试验利用亚硫酸氢盐测序（bisulfite sequencing PCR,BSP）技术和荧光定量PCR技术研究了小尾寒羊初情期前、临近初情期和初情期母羊下丘脑KiSS-1基因启动子区甲基化状态和KiSS-1基因mRNA表达量,分析两者之间的关系。结果表明：随着初情期的启动,KiSS-1基因启动子区甲基化水平显著降低,尤其是在启动子区-501位点降低最明显,并且KiSS-1基因mRNA表达量随着初情期的启动显著升高。结果提示：初情期的启动可能通过降低下丘脑KiSS-1基因启动子区特定位点甲基化水平,从而提高KiSS-1基因mRNA表达量。

Kiss-1基因在双酚A诱导的雌性性早熟大鼠下丘脑中的表达

目的:探讨Kiss-1基因在环境内分泌干扰物双酚A诱导的雌性性早熟大鼠下丘脑中mRNA的表达。方法:正常21日龄清洁级SD雌性大鼠30只,随机分为3组:正常青春前期组(组1)、正常青春期组(组2)、双酚A组(组3)。每天双酚A400mg/kg灌胃。RT-PCR法检测组1、组2和组3的Kiss-1 mRNA的表达。结果:与组1相比,组3下丘脑Kiss-1 mRNA水平增加了2.35倍,差异具有显著性(P<0.05)。组3与组2的Kiss-1 mRNA的表达差异无显著性(P>0.05)。结论:环境内分泌干扰物双酚A可导致雌性大鼠的性早熟,Kiss-1与双酚A诱发的性早熟中可能有关。

Kiss-1/GPR54系统在不同发育阶段五指山猪下丘脑中的表达

采用荧光定量技术研究Kiss-1mRNA和GPR54mRNA在30、60、90(初情期)和120日龄五指山母猪下丘脑表达情况,并检测血清中FSH、LH、E2、P4浓度变化。结果表明:初情期前,Kiss-1mRNA表达量随着五指山猪年龄的增长逐渐升高,到初情期(90日龄)时表达量达到最高(P<0.05),120日龄(初情期后)时表达量逐渐降低(P<0.05)。GPR54mRNA表达不受影响。血清FSH、LH、E2、P4浓度变化的趋势大体一致,初情期前各激素水平逐渐升高,但差异不显著(P>0.05);至初情期(90日龄)时显著升高,且达到一个峰值;血清FSH、LH和E2浓度在90日龄和120日龄时差异不显著(P>0.05),P4浓度在90日龄时显著高于120日龄(P<0.05)。结果显示:Kiss-1基因是五指山猪初情期启动的关键因子。

不同繁殖状态阿勒泰羊下丘脑MTNR1A基因表达变化与其季节性繁殖的关系

【目的】分析不同繁殖状态阿勒泰羊下丘脑褪黑素受体1A(MTNR1A)基因表达情况与其季节性繁殖之间的关系,为深入研究绵羊季节性繁殖的调控机理奠定基础。【方法】采用RT-PCR对发情盛期阿勒泰羊不同组织中的MTNR1A基因表达情况进行检测,并以q RT-PCR测定分析乏情期及发情初期、发情盛期、发情末期和间情期阿勒泰羊下丘脑MTNR1A基因的表达变化情况。【结果】MTNR1A基因在发情盛期阿勒泰羊的下丘脑、垂体、卵巢和脾脏中高表达,而在心肌、肺脏和骨骼肌中不表达或表达量极低。秋季发情季节阿勒泰羊下丘脑中MTNR1A基因的表达量极显著高于夏季乏情季节(P<0.01),但在发情前期、发情盛期、发情末期和间情期的表达量差异不显著(P>0.05);夏至后20 d下丘脑中MTNR1A基因的表达量显著高于夏至前20 d(P<0.05)。【结论】褪黑素及其受体在阿勒泰羊发情启动过程中发挥重要的调控作用。

Kiss-1在雌性性早熟大鼠下丘脑中mRNA的表达

目的探讨Kiss-1在雌性性早熟大鼠不同时期下丘脑中mRNA的表达。方法正常5日龄清洁级Sprague-Dawley雌性大鼠40只,随机分为4组,对照1组(正常青春前期),对照2组(正常青春期早期),模型1组(青春期早期),模型2组(青春期中期),每组10只,达那唑300μg皮下注射以诱导真性性早熟。半定量RT-PCR法检测对照1组,对照2组,模型1组,模型2组的Kiss-1 mRNA的表达。结果与对照1组相比,模型1组和模型2组下丘脑Kiss-1 mRNA水平分别增加了1.4和2.8倍,差异具有显著性(P<0.05)。模型2组大鼠下丘脑Kiss-1 mRNA表达水平高于模型1组,差异有显著性(P<0.05)。对照2组与模型1组的Kiss-1 mRNA的表达差异无显著性(P>0.05)。结论Kiss-1 mRNA的表达与生长发育的时期密切相关,提示Kiss-1可能与真性性早熟的发生有关。

复方地黄合剂对青春期大鼠下丘脑KiSS-1与GPR54及Ghrelin mRNA表达的影响

目的探讨中药复方地黄合剂对青春期大鼠性发育的调节作用及可能的作用机制。方法将16只SPF级4周龄SD雌性大鼠随机分为两组,正常组予0.9%NaCl溶液灌胃,中药组予复方地黄合剂灌胃。每天观察大鼠阴道口开放(VO)时间;干预2周后计算子宫、卵巢指数;Real-time荧光定量PCR法检测下丘脑组织KiSS-1及其GPR54和GhrelinmRNA的表达;ELISA法检测血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、Ghrelin以及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达浓度。结果中药组VO时间平均推迟约7d,子宫、卵巢指数较正常组均明显降低(P<0.01);中药组血清LH、Ghrelin均显著降低(P<0.01),而对FSH、IGF-1无明显影响(P>0.05);中药组KiSS-1、GPR54mRNA表达量分别降低至正常组的0.22和0.17倍,差异有显著性(P<0.01),而GhrelinmRNA变化不明显(P>0.05)。结论复方地黄合剂对青春期大鼠性发育有明显的调节作用,其作用机制可能与抑制KiSS-1、GPR54基因表达,从而影响外周FSH、LH等激素水平有关。

甘加藏羊发情周期下丘脑-垂体-卵巢轴KISS-1/GPR54的表达与分布

为了研究高原甘加藏羊(Ovis aries)发情周期下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamic-pituitary-ovary axis,HPOA)中肿瘤转移抑制基因(kisspeptins,KISS-1)/G蛋白偶联受体54(G protein-coupled receptors 54,GPR54)的表达及其对藏羊季节性发情周期的调控作用,本实验选取处于发情周期的甘加藏羊32只,应用qRT-PCR和免疫组织化学技术,检测其在发情周期HPOA组织中的表达和分布。qRT-PCR结果显示,甘加藏羊整个发情周期HPOA组织中均有KISS-1和GPR54 mRNA表达。下丘脑组织中发情前期KISS-1 mRNA相对表达量显著(P<0.05)高于其他3个发情时期;在垂体组织中发情前期和间情期的相对表达量较高,与发情后期差异显著(P<0.05);卵巢轴组织中间情期的相对表达量最高,显著(P<0.05)高于其他3个时期。下丘脑组织中发情期GPR54 mRNA相对表达量显著(P<0.05)高于其他3个时期;垂体组织中发情前期的相对表达量显著(P<0.05)高于其他时期;卵巢轴组织中发情后期的相对表达量显著(P<0.05)高于其他时期。免疫组织化学染色结果显示:Kisspeptin和GPR54阳性产物在下丘脑中主要分布于促垂体区的弓状核、脑室前腹侧区;腺垂体中主要在嗜碱性细胞和嫌色细胞中表达;卵巢轴中主要在卵泡颗粒层及卵泡内膜上表达。KISS-1和GPR54在藏羊发情周期HPOA中的差异表达,对藏羊季节性发情周期有一定的调控作用。

发育不同时期大鼠下丘脑视前区前胸腺素α1-mRNA表达水平变化及基因序列分析

目的研究胸腺素在大鼠发育不同时期在下丘脑的表达和下丘脑胸腺素的基因序列。方法运用RT-PCR定量检测和基因序列分析技术,分别检测胚胎12天、14天、16天、19天、出生当天、生后30天、60天SD大鼠下丘脑前胸腺素α1-mRNA的表达。结果从SD大鼠下丘脑视前区扩增出的前胸腺素α1-mRNA的特异性条带,序列分析结果表明,其PCR产物的基因序列与文献报道大鼠胸腺来源的完全一致;大鼠下丘脑视前区前胸腺素α1-mRNA的表达水平随大鼠发育的成熟而呈递减趋势。结论胚胎12天到生后60天大鼠下丘脑视前区表达与胸腺来源完全一致的前胸腺素α1 mRNA,随着大鼠发育成熟而逐渐减少,提示胸腺素α1在个体发育过程中可能参与大鼠下丘脑的功能调节。

疏肝泻火方对雌性中枢性性早熟大鼠下丘脑KISS-1/G蛋白偶联受体54系统的影响

目的观察疏肝泻火方对雌性中枢性性早熟(CPP)大鼠下丘脑KISS-1 mRNA、G蛋白偶联受体54(GPR54)mRNA表达水平的影响,探讨该方对KISS-1/GPR54系统的作用。方法将60只SD雌性大鼠随机分为正常对照组、模型组、亮丙瑞林组及疏肝泻火高、中、低剂量组6组,每组10只。除正常对照组外,均采用N-甲基-DL-天冬氨酸(NMA)诱导建立CPP模型,正常对照组、模型组予0.9%氯化钠注射液1.0 m L/只灌胃,疏肝泻火方高、中、低剂量组分别予8.5、4.25、2.125 g/kg的疏肝泻火方灌胃,亮丙瑞林组予注射用亮丙瑞林微球100μg/kg肌肉注射,用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)检测各组大鼠下丘脑KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA表达水平。结果各造模组KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA相对表达量均高于正常对照组(P<0.05)。亮丙瑞林组及疏肝泻火方高、中、低剂量组KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA相对表达量均低于模型组(P<0.05,P<0.01)。疏肝泻火方高、中剂量组KISS-1 mRNA相对表达量与亮丙瑞林组比较差异无统计学意义(P>0.05);疏肝泻火方低剂量组KISS-1 mRNA相对表达量高于亮丙瑞林组(P<0.05);疏肝泻火方高、中、低剂量组组间KISS-1 mRNA相对表达量两两比较均差异无统计学意义(P>0.05)。亮丙瑞林组及疏肝泻火方高、中、低剂量组GPR54 mRNA相对表达量两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论通过下调下丘脑KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA表达水平可能是疏肝泻火方治疗CPP的机制之一。

KISS-1/GPR54基因及其在生殖中的作用

KISS-1及其受体GPR54基因对青春期的正常启动具有重要作用。青春期开始前后,动物下丘脑中KISS-1和GPR54 mRNA水平很高,Kisspeptins(KISS-1基因产物)通过激活GPR54增加促性腺激素的释放,KISS-1基因的表达受性腺类固醇激素的调控。GPR54基因突变可以导致人和鼠的特发性促性腺激素分泌不足性腺机能减退症和促性腺激素依赖性性早熟。文章还介绍了KISS-1、GPR54基因的结构、表达、多态性以及和其它生殖调控因子之间的相互关系。

Kiss-1基因多态性与苏淮山羊产羔数的关联分析

为了研究Kiss-1基因多态性与苏淮山羊产羔数之间的关系,本研究采用DNA池测序技术筛选苏淮山羊Kiss-1基因突变位点,采用AS-PCR和PCR-RFLP方法检测130只苏淮山羊Kiss-1基因突变位点的多态性,并分析其与产羔数的关联性。结果表明,在苏淮山羊内含子1中发现2个突变位点g.2270C>T和g.2510A>G,其中g.2510A>G位点有3种基因型AA、AG和GG,基因型频率分别为0.209、0.496和0.295;g.2270C>T位点在苏淮山羊中共检测3种基因型(CC、CT和TT),基因型频率分别为0.143、0.750和0.107。关联分析发现,g.2510A>G位点3种基因型在苏淮山羊各胎产羔数和平均产羔数间差异不显著,g.2270C>T位点中CC型的二胎产羔数显著高于CT和TT型(P<0.05)。单倍型分析发现,g.2510A>G和g.2270C>T位点在苏淮山羊群体中共构建8种单倍型,其中AGCT是主要的单倍型;各单倍型与苏淮山羊产羔数的关联分析发现仅AGCT单倍型的头胎产羔数与AACT单倍型的头胎产羔数间差异显著,其他单倍型在苏淮山羊的各胎产羔数间差异均不显著。综合以上研究表明,Kiss-1基因的g.2270C>T位点可能对苏淮山羊繁殖性状的选育具有一定的指导作用。

肿瘤转移抑制基因KiSS-1和基质金属蛋白酶-9在肝细胞癌门静脉癌栓中的表达

背景与目的:肿瘤转移抑制基因KiSS-1与恶性肿瘤的转移具有一定关系,但它与肝细胞癌的转移特别是与门静脉癌栓形成的关系罕有报道。本实验探讨KiSS-1基因在门静脉癌栓形成中的作用及机制。方法:应用RT-PCR法和免疫组化方法检测50例肝细胞癌组织及11例门静脉癌栓组织中KiSS-1基因和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达。结果:门静脉癌栓组、伴癌栓肝细胞癌组、不伴癌栓肝细胞癌组中KiSS-1基因的mRNA阳性率分别为18.2%(2/11)、16.1%(5/31)、63.2%(12/19),蛋白阳性率分别为0%(0/11)、12.9%(4/31)、47.4%(9/19),癌栓组和伴癌栓肝细胞癌组的KiSSmRNA和蛋白阳性率均明显低于不伴癌栓肝细胞癌组(P<0.05),而癌栓组与伴癌栓肝细胞癌组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。各组中MMP-9mRNA的阳性率分别为72.7%(8/11)、77.4%(24/31)、31.6%(6/19),MMP-9蛋白的阳性率分别为81.8%(9/11)、83.9%(26/31)、42.1%(8/19),癌栓组与伴癌栓肝细胞癌组的MMP-9mRNA和蛋白阳性率之间差异均无统计学意义(P>0.05),但均明显高于不伴癌栓的肝细胞癌组(P<0.05)。KiSS-1基因与MMP-9的mRNA和蛋白阳性率均呈负相关(r值分别为-0.362、-0.473,P值均<0.05)。结论:KiSS-1基因、MMP-9与门静脉癌栓的形成密切相关,KiSS-1基因可能通过抑制MMP-9表达而抑制门静脉癌栓的形成。

猪下丘脑和垂体中生长激素受体、胰岛素样生长因子1型受体的发育性变化

GH和IGF 1可作用于垂体或 /和下丘脑负反馈性地调节垂体GH的分泌 ,而这种负反馈作用必须通过下丘脑或垂体的GHR和IGF 1R来实现。为研究猪垂体GH分泌负反馈调节的发育性变化和品种特点 ,分别在 0、3、2 0、30、90、12 0和 180日龄随机选取纯种雄性二花脸猪和大白猪各 4头 ,屠宰并取下丘脑及垂体 ,用相对定量RT PCR分析下丘脑和垂体GHR和IGF 1RmRNA水平。结果表明 :下丘脑GHRmRNA表达呈明显的时序性变化 ,在 0到 12 0日龄期间呈逐渐上升趋势 ,180日龄时显著下降 (P <0 0 5 ) ,提示在快速生长期 ,GH负反馈调控机制逐渐加强。下丘脑GHRmRNA表达还表现明显的品种间差异 ,在 0到 180日龄期间大白猪均显著高于二花脸猪 (P <0 0 5 ) ;而垂体GHRmRNA表达相对稳定 ,品种和年龄间差异不显著 ,提示GH的负反馈作用位点可能主要在下丘脑。IGF 1R与GHR的表达发育模式不同。下丘脑IGF 1RmRNA的表达相对稳定 ,无显著的年龄、品种间差异 ;而在垂体 ,大白猪和二花脸猪IGF 1RmRNA水平在出生时均较高 ,随后显著下降 (P <0 0 5 ) ,2 0日龄后逐渐上升至 90日龄的较高水平 ,随后再次下降。大白猪垂体IGF 1mRNA表达在 30日龄和 90日龄时显著高于二花脸猪 (P <0 0 5 ) ,而 180日龄时二花脸猪垂体IGF 1RmRNA水平却显著高于大白?

猪KISS-1基因克隆、序列分析

在猪的不同组织中克隆KISS-1基因,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E.coliDH5α,检测阳性克隆并测序;结果:克隆的猪KISS-1基因与牛、人、大鼠、小鼠同源性分别为81.0%、76.8%、71.4%、72.4%;克隆了猪KISS-1基因全长并注册GenBank(Accession.EU934235),猪KISS-1基因在多种组织中表达。

KISS-1基因在肾癌中的表达及对细胞侵袭力的影响

目的:检测肾癌原发灶和转移灶中KISS-1基因的表达并在体外实验中验证其缺失对细胞侵袭能力的影响。方法:选择30例肾癌患者,应用荧光定量PCR检测肾癌原发灶和转移灶中KISS-1基因mRNA的表达,应用RNA干扰技术获得KISS-1基因表达缺失的肾癌细胞株,检测干扰前后细胞的侵袭能力变化。结果:转移灶中的KISS-1mRNA表达较原发灶中明显下调,KISS-1表达与肿瘤远处转移呈显著相关。干涉前后都有细胞穿透滤膜,干涉后细胞数明显高于干涉前,细胞数分别为31±6和78±8,两组有显著差异(P<0.05)。KISS-1基因表达缺失的肾癌细胞侵袭能力明显增强。结论:KISS-1基因在肾癌中具有转移抑制作用,可能在肾癌转移治疗中发挥作用。

体外转染KISS-1基因对BGC-823细胞增殖能力的影响

目的观察KISS-1基因对人胃腺癌细胞株BGC-823增殖能力的影响,探讨KISS-1基因作为胃癌基因治疗靶点的可行性。方法利用脂质体介导在体外将KISS-1基因转染人胃腺癌BGC-823细胞,经G418筛选,建立稳定高表达KISS-1蛋白的细胞系,蛋白印迹(Western blotting)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法证实转染成功,四甲基偶氮唑盐比色(MTT)实验探讨KISS-1对胃癌细胞株BGC-823增殖能力的影响。结果 Western blotting和RT-PCR结果显示KISS-1蛋白和mRNA在转基因组的表达均高于转空质粒组和对照组(P<0.05);MTT检测结果显示转基因组细胞在转染48 h和72 h后细胞增殖能力与转空质粒组和对照组相比,细胞生长受到明显抑制(P<0.05)。结论 KISS-1基因可抑制人胃腺癌细胞株BGC-823细胞的增殖能力。

KiSS-1基因及其蛋白肽在妊娠滋养细胞疾病中的表达和意义

目的探讨KiSS-1基因及其蛋白在妊娠滋养细胞疾病中的表达及临床意义。方法用半定量RT-PCR和Westernblot方法检测30例正常早期妊娠绒毛组织、30例葡萄胎组织、9例侵蚀性葡萄胎组织和8例绒毛膜癌组织中KiSS-1mRNA及其蛋白metastin的表达。结果在正常妊娠早期绒毛组织、葡萄胎组织和侵蚀性葡萄胎组织中均有KiSS-1基因和蛋白的表达,而在绒毛膜癌组织中无KiSS-1基因和metastin的表达。葡萄胎组织的KiSS-1mRNA(0.433±0.193)和metastin表达(23.831±7.522)显著低于早期妊娠绒毛组织(P均<0.01),侵蚀性葡萄胎组织中KiSS-1mRNA和metastin表达水平更低(分别为0.113±0.121和10.814±3.431)。在绒毛膜癌组织中未检测到KiSS-1基因及其蛋白的表达。结论肿瘤转移抑制基因KiSS-1基因及其蛋白的表达变化与滋养细胞侵润活性呈负相关,是一种抑侵润基因,在滋养细胞侵润活性调控中起重要作用。