mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒靶向光热作用对下咽癌FADU细胞株和293T细胞株的温度影响

目的：探讨上皮生长因子受体单克隆抗体（epidermal grow th factor receptor monoclonal antibody ， mAb－EGFR）功能化修饰的纳米金棒靶向光热作用对下咽癌FADU细胞株和非肿瘤细胞的温度影响。方法在CTAB体系下合成实验所需纳米金棒并完成上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor ，EGFR）单克隆抗体功能化修饰，用紫外分光光度计及电镜表征；以体外培养的下咽癌FADU 细胞和非肿瘤细胞293T 细胞系为实验材料，用western blot免疫印迹法定性比较两株细胞EGFR的表达及明确细胞内吞纳米金棒；Annexin－5／PI双染法荧光显微镜观察FADU细胞和293T 细胞凋亡情况；设定不同剂量纳米金浓度（15％、25％、35％），应用808 nm波长近红外激光照射6分钟，每隔一分钟检测细胞培养介质温度，并用X T T 法检测细胞存活率。结果纳米金棒浓度在15％～25％、近红外激光照射6分钟时，细胞温度为41～43℃，并且趋于稳定，对下咽癌细胞有明显的杀伤作用（P＜0．05），而对293T 细胞没有明显的杀伤作用，而纳米金棒浓度在35％时对下咽癌 FADU细胞和293T细胞都具有明显的杀伤作用（P＜0．05）。结论浓度为15％～25％ mAb－EGFR功能化修饰的纳米金棒在近红外激光照射6分钟时细胞温度升至41～43 ℃，对下咽癌细胞具有明显的杀伤作用，而对非肿瘤细胞无明显损伤。

京尼平对下咽癌FaDu细胞增殖及线粒体功能的影响

目的:探讨解偶联蛋白2(UCP2)抑制剂京尼平(GEN)对人下咽癌FaDu细胞增殖及线粒体功能的影响。方法:使用不同浓度的GEN作用于FaDu细胞24 h,实验分为GEN 0(对照)、50、100、200和400μmol/L组。采用CCK-8法检测各组细胞增殖能力,DCFH-DA探针及JC-1染色联合流式细胞术检测GEN对FaDu细胞活性氧(ROS)含量及线粒体膜电位的影响,激光共聚焦显微镜观察GEN对FaDu细胞线粒体膜通透性转换孔的影响,可见分光光度法检测细胞中乳酸的含量,WB法检测细胞中UCP2蛋白的表达变化。结果:与对照组相比,GEN可显著抑制FaDu细胞的增殖活力(P<0.05或P<0.01)、细胞中UCP2蛋白的表达(P<0.05),降低线粒体膜电位(P<0.05或P<0.01)、乳酸含量(P<0.0001),改变细胞线粒体膜孔道通透性,提高细胞中ROS水平(P<0.05或P<0.01)。结论:GEN通过调节细胞中UCP2的表达水平进而影响细胞的氧化还原能力及线粒体功能,从而发挥抑制人下咽癌FaDu细胞增殖并诱导细胞凋亡的作用。

SOX4在下咽癌中的表达及其对癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 :分析下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinomas,HSCC)组织中SRY相关HMGbox转录因子4(SRY-box transcription factor-4,SOX4)的表达及其与患者临床病理特征及预后的关系。观察siRNAs敲低FaDu人咽鳞癌细胞中SOX4表达对细胞增殖、迁移及裸鼠成瘤的影响。方法:(1)选取下咽癌石蜡切片标本76例,癌旁正常组织标本18例作为对照,采用免疫组化检测SOX4和Ki67的表达水平。(2)选取6对新鲜的下咽癌组织和相邻正常组织,采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测SOX4表达水平。(3)运用siRNAs敲低FaDu细胞中SOX4表达。(4)饥饿释放实验检测SOX4在增殖期FaDu细胞中的表达水平,CCK-8法检测FaDu细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期的分布,Transwell试验和划痕实验检测细胞迁移能力。(5)Western blot检测上皮间充质转化(epithelial mesendyinal transition,EMT)相关分子的表达。(6)裸鼠成瘤实验观察SOX4对肿瘤生长的影响。结果:(1)与癌旁正常组织相比,HSCC组织中SOX4表达明显升高,与肿瘤分化程度、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移及Ki67表达相关(P<0.05)。(2)SOX4高表达患者生存期较短。(3)增殖期FaDu细胞SOX4和PCNA的表达同步明显增加。(4)SOX4-Si2处理后FaDu细胞中SOX4染色强度显著降低,细胞增殖能力明显下降,细胞停滞于G1期,S期细胞减少。(5)SOX4-Si2干扰后FaDu细胞划痕愈合能力明显下降,细胞迁移数减少,上皮表型标志物β-连环蛋白和E-钙粘蛋白表达显著增加,而间质表型标志物波形蛋白和N-钙粘蛋白表达显著降低。(6)裸鼠成瘤实验显示,SOX4-Si2干扰后裸鼠肿瘤生长受到显著抑制,Ki-67阳性率增高。结论:SOX4在HSCC中过表达,SOX4在体内外对下咽癌的进展和迁移起着重要作用,可作为下咽癌患者诊断和治疗的分子靶标。

三七皂苷R1调控PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞凋亡和自噬

目的:探讨三七皂苷R1(notoginsenoside R1,NGR1)对人下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)FaDu细胞凋亡以及自噬的影响,并对其涉及的信号通路进行研究。方法:75μmol/L、150μmol/L、300μmol/L NGR1作用于FaDu细胞24 h后,采用MTT检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡;自噬双标腺病毒检测自噬流;Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平。结果:NGR1能够抑制FaDu细胞的增殖并促进细胞凋亡;NGR1可诱导FaDu细胞自噬,并呈一定浓度依赖性;Western blot结果显示,NGR1作用于Fa Du细胞24 h后,LC3Ⅱ表达明显增加,而p-PI3K、p-AKT、p-m TOR表达相较于Control组明显下降。结论:NGR1可抑制Fa Du细胞增殖,诱导细胞凋亡与自噬,其机制可能与抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路有关。

STIM1基因在人下咽癌细胞系FaDu中的表达及对细胞凋亡的影响

目的探索STIM1基因在人下咽癌细胞系Fa Du中的表达情况及其表达沉默后对细胞凋亡的影响。方法培养人下咽癌Fa Du细胞,根据不同慢病毒感染分2组。STIM1-siRNA组为经STIM1-siRNA慢病毒感染的下咽癌细胞;对照组为经阴性对照慢病毒感染的下咽癌细胞。Real-Time PCR法检测STIM1在人下咽癌Fa Du细胞中的表达以及siRNA慢病毒感染后STIM1mRNA水平的表达;Western blot检测siRNA慢病毒感染后STIM1在蛋白水平的表达;流式细胞仪检测STIM1基因沉默后的人下咽癌Fa Du细胞的凋亡情况。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。结果以GAPDH为内参(Ct=12.08±0.05),STIM1在下咽癌细胞系Fa Du中表达显著(Ct=22.21±0.05,P<0.01);Real-time PCR结果显示对照组和STIM1-siRNA组人下咽癌Fa Du细胞的表达值分别为(1.00±0.08)和(0.12±0.01),2组差异具有统计学意义(P<0.01);Western blot的结果显示,STIM1-siRNA组Fa Du细胞中STIM1蛋白明显受抑制,与Real-time PCR结果一致,慢病毒感染成功;流式细胞仪检测结果显示对照组凋亡率为(4.36±1.32)%;实验组凋亡率为(9.81±0.56)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 STIM1基因与人下咽癌Fa Du细胞凋亡显著相关,人下咽癌Fa Du细胞中,STIM1可能抑制凋亡,可能成为下咽癌诊治的全新切入点。

STIM1基因在人下咽癌细胞系FaDu中的表达及对细胞凋亡的影响分析

目的分析人下咽癌细胞系FaDu中STIM1基因对细胞表达及凋亡的影响。方法随机选取2020年3月—2022年3月期间深圳市萨米医疗中心耳鼻咽喉科收取的40份咽癌患者细胞作为培养对象。经STIM1-siRNA病毒感染的下咽癌细胞为STIM1基因组,经阴性慢病毒感染的下咽癌细胞为对照组,各20份。比较两组病毒感染后蛋白水平表达及细胞凋亡、增殖、生长能力。结果STIM1基因组细胞蛋白水平表达(0.75±0.23)低于对照组(0.96±0.21),差异有统计学意义(t=3.015,P=0.005);STIM1组细胞凋亡情况高于对照组,差异有统计学意义(t=13.287,P<0.05);STIM1基因组细胞数高于对照组,差异有统计学意义(t=8.207,P<0.05)。结论在人下咽癌细胞系FaDu中,STIM1基因使下咽癌细胞的增殖及细胞数提升,蛋白水平、增殖倍数被抑制,说明STIM1是调控下咽癌发生发展的关键因子,可作为下咽癌治疗中全新切入点。

人鼻咽上皮细胞株HNE-1染色体高分辨显带的研究

作者首次采用高分辨染色体G显带技术,对本室建立的人鼻咽癌上皮细胞株“湖南一号”(HNE-1)进行了细胞遗传学研究。HNE-1细胞株在第15代时,染色体数目变异在68—78之间,众数为74。所检细胞均含有结构异常的染色体。出现频率比较高的标记染色体15条,其中某些标记染色体只有在高分辨染色体上才清楚地显示出结构重排。此外还发现少数细胞内存在双微体和核内复制。与其它鼻咽癌上皮细胞株比较,发现7号染色体部分缺失del(7)(q32)在CNE、HNE-1及鼻咽癌活检组织中同时存在,这一标记染色体可能与鼻咽癌的发生有重要联系。

紫草素通过上调RIP1、RIP3蛋白诱导下咽癌细胞发生坏死性凋亡

目的探究紫草素对下咽癌细胞(Fadu)的增殖和死亡的影响。方法不同浓度的紫草素(0,2,4,6,8,10μmol/L)分别处理Fadu细胞24,48,72 h,检测细胞的存活率,其中0μmol/L组为空白对照组。MTT法检测紫草素对Fadu细胞增殖的影响;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测不同浓度紫草素(0,2,4,6μmol/L)作用于Fadu细胞24 h的凋亡率;Western blot法检测紫草素作用Fadu细胞后Bcl-2、Bax、RIP1、RIP3蛋白相对表达水平。结果 MTT结果显示,紫草素对Fadu细胞的增殖抑制作用呈时间依赖性及剂量依赖性(P <0. 05),24,48,72 h的IC50分别为6. 012,4. 120,3. 939μmol/L;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法可知紫草素可随浓度依赖性诱导Fadu细胞凋亡;Western blot结果显示,紫草素(2,4,6μmol/L)可以下调Bcl-2和上调Bax,诱导Fadu细胞凋亡,上调RIP1、RIP3蛋白诱导下咽癌细胞坏死性凋亡。结论紫草素可诱导Fadu细胞的凋亡和坏死性凋亡,凋亡机制可能为下调凋亡抑制蛋白Bcl-2和上调凋亡诱导蛋白Bax的表达,坏死性凋亡的机制可能为上调RIP1、RIP3蛋白的表达。

去甲肾上腺素对FaDu鳞癌细胞系生物学行为的影响

目的研究去甲肾上腺素对人咽鳞状细胞癌细胞系FaDu增殖、侵袭及迁移等细胞生物学行为的影响。方法分别采用MTT实验、Transwell细胞侵袭及迁移实验和划痕实验检测不同浓度去甲肾上腺素对人咽鳞状细胞癌细胞系FaDu增殖、侵袭及迁移能力的影响,同时观察普萘洛尔预处理对去甲肾上腺素作用的干预效果。结果 MTT实验、Transwell实验和划痕实验结果表明浓度为10μmo/L的去甲肾上腺素可以显著促进人咽鳞状细胞癌细胞系FaDu的增殖、侵袭及迁移(P<0.001),而浓度为1μmol/L的普萘洛尔预处理可以有效抑制去甲肾上腺素对人咽鳞状细胞癌细胞系FaDu增殖、侵袭及迁移的促进作用(P<0.001)。结论去甲肾上腺素对人咽鳞状细胞癌细胞系FaDu的增殖、侵袭及迁移有促进作用,而非选择性β肾上腺素能受体阻断剂普萘洛尔可以抑制该促进作用。

Wnt/β-catenin通路在鼻咽癌分化中的作用

【目的】探讨Wnt/β-catenin通路的枢纽分子β-catenin和β-catenin/Tcf复合体在不同分化程度鼻咽癌中的表达,进而阐明Wnt/β-catenin通路对鼻咽癌分化的作用。【方法】采用免疫组化方法检测13例鼻咽粘膜慢性炎症和74例不同分化类型的鼻咽癌组织中β-catenin的表达;转染野生型和突变型Tcf荧光素酶报告质粒,检测β-catenin/Tcf复合体在高低分化鼻咽癌细胞株中的含量。【结果】β-catenin在鼻咽癌中的异常表达主要出现在细胞浆内过表达。在角化性鳞癌、分化型非角化性癌中β-catenin胞浆内的过表达相对少,而在未分化癌中胞浆内累积明显增多。未分化癌与角化性癌、未分化癌与分化型非角化性癌相比较,β-catenin的表达有统计学差异,P值分别为0.0195和0.0003。通过检测转染后荧光素酶活性发现β-catenin/Tcf复合体在低分化鼻咽癌细胞株(CNE-2和HONE-1)中的表达是高分化鼻咽癌细胞株(CNE-1)的80～123.6倍。【结论】低分化鼻咽癌细胞比高分化鼻咽癌细胞有更高水平的胞浆内β-catenin和核内β-catenin/Tcf的表达,说明前者的Wnt/β-catenin通路比后者明显地处于更高的活化状态中,提示Wnt/β-catenin通路可能在抑制鼻咽癌细胞的分化中起重要作用。

双氢青蒿素对人下咽癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的明确不同浓度双氢青蒿素(DHA)抑制人下咽癌细胞Fadu裸鼠移植瘤生长的效应。方法细胞克隆形成实验分析DHA体外抑制肿瘤形成能力;建立Fadu裸鼠移植瘤模型,腹腔注射低、中、高浓度DHA作为DHA处理组,腹腔注射顺铂作为化疗组;测量移植瘤的体积,干预3周后剥离瘤块,判断不同浓度DHA抑瘤率及抑瘤效果;根据体重变化及肝、脾、肾的重量变化,判断DHA是否有潜在的毒性。结果 (1)DHA抑制Fadu细胞的体外生长;(2)DHA低(25 mg/kg)、中(50mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量组的抑瘤率分别为39.74%、60.52%、78.70%,顺铂组的抑瘤率为79.22%;(3)DHA对裸鼠体重及肾重量无影响,能增加荷瘤裸鼠的肝、脾重量。结论低、中剂量DHA虽能抑制Fadu移植瘤生长,但抑瘤效果不如顺铂;高剂量DHA抑瘤效果与顺铂相同,且没有明显的肝、肾、脾毒性作用。

mAb-EGFR功能化修饰的金纳米棒靶向光热作用对人咽鳞状细胞癌FaDu细胞株和293T细胞株的细胞毒性分析

目的：探讨mAb-EGFR功能化修饰的金纳米棒靶向光热作用对人咽鳞状细胞癌FaDu细胞株和对非肿瘤细胞的细胞毒性,初步明确特定吸光度的金纳米棒在体外实验中所需剂量。方法：在CTAB体系下合成实验所需金纳米棒并且完成EGFR单克隆抗体功能化修饰,用紫外分光光度计及电镜表征,以体外培养的人咽鳞状细胞癌FaDu细胞和非肿瘤细胞293T细胞系为实验材料,用Western blot免疫印迹法定性比较两株细胞EGFR的表达,及明确细胞内吞金纳米棒。设定不同剂量金纳米棒浓度（15%、25%、35%）,乳酸脱氢酶法比较金纳米棒对FaDu细胞株和293T细胞株毒性差异及初步明确实验剂量。结果：金纳米棒对于FaDu细胞株的细胞毒性高于293T细胞株（P〈0.01）,在293T细胞株实验组中金纳米棒剂量浓度15%、25%两组间无明显差异,而这两组与35%剂量比较均差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：mAb-EGFR功能化修饰的金纳米棒在近红外激光照射时对人咽鳞状细胞癌细胞作用表现出比非肿瘤细胞更高的细胞毒性,对于特定吸光度功能化修饰的金纳米棒光热作用杀伤人咽鳞状细胞癌FaDu细胞株的安全剂量浓度为15%~25%。

双氢青蒿素对下咽癌Fadu细胞内质网应激途径的作用

目的探讨双氢青蒿素(DHA)抑制下咽癌Fadu细胞增殖的机制,为其应用于临床抗肿瘤治疗提供理论依据。方法应用含不同浓度葡萄糖(5.5、10、15、25、50、100 mM)培养基,培养Fadu细胞36 h,Western blot检测p-STAT3及内质网应激相关蛋白GRP78的表达情况。应用不同浓度(10、20、40、80、160 μM)DHA在培养基糖浓度为25 mM条件下处理下咽癌Fadu细胞,24 h后用MTT比色法检测对细胞增殖的影响;Western blot检测p-STAT3、GRP78的表达情况。结果 DHA抑制下咽癌Fadu细胞增殖,且具剂量依赖性;低糖培养基可以降低p-STAT3的表达,增加GRP78的表达;DHA抑制p-STAT3表达,低浓度DHA刺激GRP78表达,随着浓度逐渐增高则抑制其表达。结论 DHA可以显著抑制下咽癌Fadu细胞的增殖,抑制p-STAT3的表达,诱导内质网应激,其作用机制可能与干扰细胞糖代谢密切相关。

纳米金颗粒的制备及其生物相容性研究

目的制备纳米金颗粒并初步探讨其生物相容性。方法采用柠檬酸钠还原法合成纳米金颗粒(GNPs),通过透射电子显微镜(TEM)观察其尺寸和形貌,利用光谱仪记录所制得的纳米金溶液的紫外-可见光谱(UV-Vis)。体外实验运用MTT比色分析法研究纳米金颗粒的细胞毒性;体内实验通过HE染色观察注射纳米金颗粒后动物心、肝、脾、肾的组织学变化。结果TEM表征和紫外-可见光谱结果显示成功合成直径均一的球形纳米金颗粒。MTT结果显示一定浓度的纳米金颗粒不影响人咽鳞状细胞癌细胞系Fa Du的增殖,无细胞毒性。HE染色结果显示所有动物心、肝、脾、肾组织无组织学变化和毒副反应。结论成功制备了生物相容性良好的纳米金颗粒,展现出潜在的临床应用前景。

兔梨状隐窝VX2瘤模型的建立及解剖与影像学观察

目的建立兔梨状隐窝VX2移植瘤模型。方法先以VX2细胞在新西兰大白兔制备移植瘤并传代,再将兔移植瘤制备组织悬液(组织块约1mm^3大小,约含1～2×10~6/m1个细胞),直达喉镜下接种于17只兔梨状隐窝,然后行影像学观察及瘤体组织学鉴定,分析成瘤率及生长特性。结果移植瘤组织悬液2～4周后,影像检查及瘤体解剖证实,16只兔梨状隐窝内形成了移植瘤,成瘤率为94.1%,但90%荷瘤兔在4周内死亡。结论 VX2细胞移植瘤组织制备瘤组织悬液、直达喉镜下接种于梨状隐窝的方法 ,能够成功制备兔喉咽癌移植瘤模型。