黄曲霉中pyrG筛选标记循环利用的方法

为解决黄曲霉遗传转化操作过程中遗传筛选标记受限及传统URA3/pyrG环出系统存在重复序列残留的问题,以具有尿嘧啶营养缺陷的黄曲霉CA14PTs(Δku70ΔpyrG)菌株为出发菌,利用pyrG筛选标记构建表达HA-SumO的重组菌株GHS(pyrG+),再通过重叠PCR法构建包含GHS(pyrG+)基因组中pyrG整合位点上、下游片段的融合片段,导入GHS(pyrG+)菌株原生质体,利用DNA同源重组和5-氟乳清酸(5-FOA)的负筛选剔除pyrG筛选标记,重新获得具有尿嘧啶营养缺陷的重组菌株GHS(pyrG-).通过测序分析,确认GHS(pyrG-)重组菌株基因组中的pyrG筛选标记已被剔除且无其他序列残留.免疫杂交分析结果表明,剔除pyrG筛选标记不影响重组菌株的蛋白表达模式.