微重力抑制斑马鱼抗病毒先天性免疫应答的分子机制研究

目的空间微重力环境一方面导致机体免疫功能紊乱,另一方面能够使航天员体内潜伏性病毒再激活且致病力增强,这严重威胁了航天员在轨期间的工作状态及生命健康。已有研究表明,微重力导致斑马鱼抗病毒先天性免疫应答能力显著下降,但具体调节机制仍不清晰。因此,本研究旨在探究微重力调控斑马鱼抗病毒免疫应答的作用方式及调控网络。方法使用回转细胞培养系统(RCCS)构建地基模拟微重力条件下斑马鱼胚胎发育模型,分析微重力对其发育过程的影响,并结合分子克隆技术明确多个基因的表达变化情况。随后,借助鲤春病毒血症病毒(SVCV)感染,揭示微重力抑制机体抗病毒免疫应答的调控机制。结果在微重力条件下,斑马鱼胚胎发育的存活率、畸形率等生理指标均发生显著变化,但不具有时间依赖性。此外,微重力显著增强了斑马鱼CD82基因和ppdpf基因上调表达。体外实验表明,过表达CD82基因和ppdpf基因能抑制机体SVCV诱导的IFN表达,并使病毒滴度增加。而敲降上述基因后,poly(I:C)和SVCV诱导的IFN表达则显著上升。结论微重力影响了斑马鱼早期胚胎发育过程,并通过上调CD82和ppdpf基因表达抑制机体IFN介导的抗病毒免疫应答过程。相关研究为微重力环境下机体免疫功能紊乱的作用机制奠定基础。

血管内皮功能调节酶pCDH-Myc-UBR5分子克隆的构建

目的构建pCDH-Myc-UBR5重组质粒,并探究泛素蛋白连接酶E3组分N-识别蛋白5(UBR5)在调控血管生成方面的生物学功能。方法以人乳腺癌细胞(MCF7)的互补DNA(cDNA)为模板,将UBR5基因编码区序列分为前后两段,经聚合酶链式反应(PCR)扩增。两段扩增序列插入到真核表达载体pCDH-Myc中,通过菌液PCR及DNA测序鉴定插入片段。将重组质粒瞬时转染至人胚胎肾细胞(HEK293T)中,通过蛋白质印迹法检测Myc-UBR5蛋白的表达。为了验证UBR5蛋白的功能,通过免疫共沉淀实验检测UBR5与先天性角化不良1(DKC1)蛋白的相互作用。结果成功构建pCDH-Myc-UBR5重组质粒。经菌液PCR及DNA测序证实UBR5扩增序列成功插入到pCDH-Myc载体中,并在HEK293T中表达。免疫共沉淀实验发现UBR5与DKC1存在相互作用。结论通过分子克隆技术可成功构建pCDH-Myc-UBR5质粒并在细胞中正确表达。UBR5与血管生成调控蛋白DKC1存在相互作用。

同源重组介导的克隆策略研究进展

随着基因功能的深入研究,构建表达载体是研究各基因的功能及其相互关系的第一步。近年来涌现的多种同源重组介导的高效克隆策略极大地方便了载体的构建。简要综述了同源重组介导的克隆方法的研究进展,及其在载体构建中的应用。

黄早四泛素连接酶Rbx1的分子克隆及原核表达

通过RT-PCR方法和基因克隆技术对黄早四Rbx1基因进行分子克隆和序列分析,构建黄早四Rbx1的原核表达系统,成功表达出带有His标签的黄早四Rbx1融合蛋白,并进一步利用His抗体,用蛋白免疫印迹的方法对重组蛋白进行鉴定。结果表明,重组蛋白能够与His抗体发生免疫反应,验证了黄早四Rbx1在原核表达系统中成功表达。

检测miRNA活性的双荧光素酶单载体

本研究报道了微小RNA靶分子鉴定及其活性分析的内参内置型双荧光素酶单载体与其应用.利用非连接酶依赖的基因克隆技术,借助一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法,将萤火虫荧光素酶基因(Firefly luc)融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因(Renillaluc)和氨苄青霉素抗性基因之间,构建为两种荧光素酶基因表达框并置的单载体报告系统,命名为pMiSensor.在海肾荧光素酶基因的3'非翻译区引入多克隆位点Xba I和Apa I,便于克隆目的基因的3'UTR.海肾荧光素酶为报告基因,萤火虫荧光素酶为内参基因.多种哺乳动物细胞系的转染实验证实,pMiSensor可同时有效表达两种报告基因,其酶活显示出宽广的线性范围.通过构建pMiSensor-CCNE1报告载体,证明pMiSensor能够重现miR16对细胞周期蛋白CCNE1的调控作用.通过转染miR16抑制剂,证明pMiSensor-CCNE1可作为一种灵敏的生物感应器,探测细胞内微小RNA的活性变化.该双荧光素酶单载体具有重复性高、操作简便、定量准确的优点,适用于微小RNA靶分子的筛选、鉴定和确认,也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化.

人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10在大肠埃希菌中的诱导表达与鉴定

目的构建稳定表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C/UbcH10)蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导其表达,纯化并鉴定该重组蛋白。方法通过PCR扩增获得UbcH10基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达载体,经EcoRI/XhoI双酶切及测序验证正确后,转化至大肠埃希菌BL21,经IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达4h。采用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,用Ni-Sepharose亲和层析和Sephadex G-50分子筛纯化UbcH10蛋白。结果成功构建UbcH10基因的原核表达载体,经IPTG诱导后在大肠埃希菌BL21中获得大量重组蛋白。该重组蛋白以可溶形式表达,表观分子量约为29kD,表达量约占菌体蛋白总量的40%。Western blotting检测在29kD附近出现预期条带,与目的蛋白的理论计算值相吻合。纯化后的UbcH10蛋白终浓度为8.82mg/ml,纯度达90%以上。结论成功表达并纯化了UbcH10重组蛋白,为进一步研究其结构、功能以及该蛋白在肿瘤发生发展过程中的作用奠定了基础。

重组人源化单克隆抗体rhumAb1分子大小变异体的研究

利用分子排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）、非还原毛细管电泳（CE-SDS）并结合液质联用（LC-MS）、抗体依赖细胞介导的细胞毒活性检测（ADCC）等技术对重组人源化单克隆抗体（rhumAb1）在高温（40℃）条件下产生的分子大小变异体进行研究。本研究鉴定了rhumAb1在SEC-HPLC分析中的4个分子大小变异体（SEC-1-SEC-4）和非还原CE-SDS中的7个主要变异体（NR-1-NR-7）的组成和结构。发现主要的低分子量变异体（片段）是由于重链的铰链区断裂所致,断裂位于铰链的Ser221-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys228区域,其中C222-D223和H226-T227为主要断裂位点。ADCC活性检测表明,rhumAb1分子大小变异体（二聚体和片段）显著降低了产品的活性。该研究为rhumAb1产品的质量标准和相应的质控策略的制定奠定了基础,也为其他抗体药物的质量控制提供了参考。

Pseudomonas putida ND6中两个高度同源catA基因的分离、克隆及比较

【目的】分别对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ND6基因组中基因高度同源的儿茶酚1,2-双加氧酶基因catA_1、catA_2进行克隆和原核表达,并进行生物信息学分析和酶学性质比较。【方法】通过生物信息学软件对catA_1和catA_2进行序列分析和进化树构建,利用经典的酶切连接方法和核酸外切酶III介导的无缝连接两种方法分别对catA_1和catA_2进行了表达载体的构建,对表达产物的酶学性质(最适反应温度,最适反应p H,耐热性,底物特异性等)进行了研究。【结果】catA_1和catA_2在基因序列上相似性为73.57%,两个酶的最适反应p H均为7.4,最适反应温度分别为45℃、50℃,Km值分别为1.28、1.66μmol/L,酶活力单位分别为9.00、8.35 U/mg,两个酶对儿茶酚和4-甲基儿茶酚具有较好的反应活性,在C12O分类中属于同一类型。【结论】本研究通过两种方式成功构建了高度同源性两个基因的表达载体,对于分离高同源性基因有一定的参考意义,同时通过对ND6菌株中同工酶的酶学性质进行研究和比较,加深了对ND6萘降解机制的理解,进一步探讨了冗余降解基因存在的意义。

组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原的原核表达及初步临床应用

目的通过克隆人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因，构建重组表达质粒，获得具有免疫活性的纯化重组蛋白，建立间接ELISA法，并探讨其在检测多发性肌炎／皮肌炎（PM／DM）中的抗Jo-1抗体的价值。方法构建重组表达载体，在大肠杆菌DH5仪和B121（DE3）中表达；融合蛋白经Ni-NTA树脂柱进行亲和层析纯化，并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫印迹（WB）进行免疫活性鉴定；应用表达蛋白建立间接ELISA法。同时用该方法检测30名正常献血者，30例SLE，30例类风湿关节炎（RA），10例原发性干燥综合征（SS），75例PM／DM患者血清中抗Jo-1抗体。结果经重组质粒测序和酶切结果证实，Jo-1目的基因已正确插入原核表达载体中，基因序列正确，符合表达框架；经SDS-PAGE检测显示，表达产物在相对分子质量55000处有一明显的蛋白表达条带；WB分析表明，重组蛋白具有人Jo-1抗原反应性；间接ELISA法检测标本血清结果显示，PM／DM组中抗Jo-1抗体的阳性率为28％，非PM／DM组（疾病对照组及正常对照组）均为阴性，其差异均有统计学意义（r=31．84，均P〈0．01）。结论成功克隆了人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因，其可在大肠杆菌中表达，且重组自身抗原具有较好的抗原性和特异性。应用纯化融合蛋白建立的间接ELISA法检测PM／DM抗Jo-1抗体具有较好的特异性。

人CACNA2D3基因真核表达载体的构建及在食管鳞癌细胞中的表达

目的:构建电压依赖型钙离子通道基因CACNA2D3(calcium channel,voltage-dependent,alpha 2 delta subunit 3)真核表达载体,为进一步研究其在食管鳞癌发生发展中的作用打下基础。方法:利用RT-PCR技术扩增CACNA2D3基因编码序列,并将其克隆到真核表达载体pc DNA3.1(+)载体中,经双酶切和测序鉴定后转染到人食管癌细胞系EC109中,通过QRT-PCR技术检测CACNA2D3基因的表达情况。结果:从正常组织c DNA中扩增出CACNA2D3基因片段,大小与预期一致;得到的pc DNA3.1-CACNA2D3重组质粒通过双酶切和电泳后符合预期片段,进一步测序鉴定显示插入片段序列与Gen Bank中CACNA2D3的序列一致;重组质粒转染食管鳞癌细胞EC109后CACNA2D3基因在转录水平表达明显增高。结论:成功构建了pc DNA3.1-CACNA2D3重组质粒,并完成了在食管癌细胞EC109中的外源表达,为进一步研究其生物学功能奠定基础。