可诱导共刺激分子诱导骨髓来源不成熟树突状细胞特异性分泌IL-6

目的:分析可诱导共刺激分子(ICOS)可溶性融合蛋白(ICOSIg)能否向不成熟DCs传递逆向信号及其性质。方法:以流式细胞仪结合特异性抗体检测DCs表型分子改变;以ELISA检测培养上清细胞因子变化;以RT-PCR检测各组DCs细胞内细胞因子及受体、趋化因子等mRNA表达水平。结果:ICOSIg或膜锚定ICOS作用于不成熟DCs,均可诱导其高表达MHC-Ⅱ、CD80、CD86和CD83等表型分子;促进DCs特异性分泌IL-6。结论:ICOS作用于不成熟DCs表面的ICOSL可以向DCs细胞传递逆向信号,诱导DCs细胞高分泌IL-6,同时其表面重要的表型分子也上调,可能参与了DCs细胞免疫功能的调节,其信号转导机制可能涉及p38-MAPK通路。

四种细胞因子组合从小鼠骨髓细胞体外诱导优势不成熟CD8a＋DC

【目的】探索从小鼠骨髓细胞体外诱导大量优势不成熟CD8a+DC(DC2)的新方法。【方法】取小鼠骨髓细胞,采用GM-CSF5ng/mL,IL-420ng/mL,Flt3L25ng/mL,SCF100ng/mL4种细胞因子组合,37℃,5%CO2体外培养诱导。第3、7、16天流式细胞术4色荧光标记法分析细胞表型,细胞计数分析总细胞产量,采用电镜、免疫荧光及相差摄影观察细胞形态。【结果】小鼠骨髓细胞经GM-CSF+IL-4+Flt3L+SCF诱导第3天在CD11c+的DC细胞群中可产生97.09%的CD8a+优势DC2细胞(占总细胞的34.6%),其中CD8a+MHCⅡ-的不成熟DC占61.77%;随培养时间延长比例下降,但培养第16天时CD8a+的不成熟DC仍占优势。总细胞计数分析显示随培养时间延长,细胞总数下降。电镜、免疫荧光及相差摄影等形态学检查显示所诱导的DC呈现典型树突状形态特征。【结论】GM-CSF+IL-4+Flt3L+SCF可以体外快速诱导小鼠骨髓细胞产生大量优势不成熟CD8a+DC,是体外制备不成熟DC2的一种较好的新方法。

大鼠骨髓主要细胞成分的分离获取及其免疫调节作用

目的:建立分离获取大鼠骨髓主要细胞成分的方法,了解其免疫调节作用,为骨髓主要细胞成分输注诱导同种异基因移植物免疫耐受奠定基础。方法:采用密度梯度离心法、红细胞裂解法及细胞培养等方法,分离纯化供体大鼠骨髓细胞(donor bone marrow cells,DBMC)、骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)、不成熟树突细胞(immature dendritic cells,imDC),经光镜、电镜形态学、FCM测定imDC表面OX-62、MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达、MSC表面CD80-CD86-和CD29表达等细胞表面标志的表型鉴定后,用MTT法检测DBMC、MSC和imDC对供受体混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocytesreaction,MLR)的免疫调节作用。结果:分离获取大鼠骨髓主要细胞成分纯度可达85%-90%,活力>95%,均经光镜、电镜形态学、FCM等表型鉴定合格,其中,imDC表面OX-62、MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达量分别是90.5%±16.4%、89.5%±6.2%、32.5%±9.2%和27.6%±8.3%;MSC表面CD80-CD86-和CD29表达量分别是86.068%±10.33%和61.77%±6.79%。MLR表明大鼠骨髓主要细胞成分对MLR均有显著抑制作用(P<0.05),DBMC对MLR具有供体特异性免疫调节作用。结论:建立的大鼠DBMC、MSC、imDC分离纯化方法简便易行,所获取的细胞活力、纯度高,可用于实验目的。DBMC、MSC、imDC对受体淋巴细胞增殖反应均有不同程度的免疫调节作用。

调节性T细胞核转录因子Foxp3和CD206在蕈样肉芽肿不同病程中的表达

目的：分析早期和进展期蕈样肉芽肿中调节性T细胞和不成熟树突状细胞的浸润情况，探讨这2种细胞在疾病发展中的作用及意义。方法：采用免疫组化EnVision二步法，检测20例早期（IA～ⅡA）、13例进展期（ⅡB～ⅣB）蕈样肉芽肿患者皮损活检标本中调节性T细胞核转录因子Foxp3和不成熟树突状细胞表面标志物CD206的表达情况。结果：Foxp3的表达在蕈样肉芽肿早期明显高于进展期（P〈0．05），CD206的表达在蕈样肉芽肿的进展期明显高于早期（P〈0．05）。结论：调节性T细胞在蕈样肉芽肿的早期起主导作用，不成熟树突状细胞在进展期起主导作用，提示这两种细胞可能与疾病的进展有关。

联合输注供体特异性不成熟树突状细胞及环胞素A对受体Th1/Th2淋巴细胞分化的影响

目的探讨联合应用体外培养供体特异性不成熟树突状细胞及环胞素A(CsA)对受体体内Th1 /Th2淋巴细胞分化的影响。方法建立大鼠同种异体原位肝移植模型 ,88只LWE大鼠和SD大鼠随机分为 3组 :(1 )对照组 :术后不予免疫抑制剂 ;(2 )CsA组 :术后第 2天起隔日腹腔内按1mg/ 1 0 0 g 体重注射CsA ,共 3次 ;(3)CsA +DC组 :除术后按CsA组腹腔注射CsA外 ,第 8天阴茎背静脉注射 1 0 6个供体骨髓体外培养的不成熟树突状细胞 (DCim)。术后观察各组的生存时限及 5、1 0、1 5、2 5d分别取标本行肝脏免疫病理学检查、腹腔淋巴结中INF γmRNA、IL 6mRNA含量的检测。结果CsA +DC组的生存时限为 (2 7 0± 1 0 )d ,较对照组及CsA组显著延长 (P <0 0 5 ) ;CsA +DC组受体腹腔淋巴结中的INF γmRNA含量较对照组及CsA组低 (P <0 0 5 ) ,而IL 6mRNA含量则较前两组升高 (P <0 0 5 )。结论联合应用环孢素A和体外培养的供体特异性DCim后受体体内Th2型淋巴细胞含量升高 ,而Th1型淋巴细胞含量降低 ;通过调节受体体内Th1

小鼠CCR7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的：构建含有小鼠趋化因子受体-7（CCR7）基因的重组腺病毒，为下一步转染不成熟树突状细胞（imDC）诱导免疫耐受研究奠定基础。方法：提取小鼠胸腺总RNA，应用逆转录PCR（RT-PCR）方法，以自行设计的带有酶切位点的引物，扩增获得CCR7基因全部序列，经过T-A克隆，酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上，在BJ5183菌内和pAdeasy-1同源重组，筛选阳性克隆，酶切鉴定，线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、PCR鉴定及扩增，得到含有CCR7基因的重组腺病毒，根据报告基因GFP测定病毒滴度。结果：成功构建小鼠CCR7基因重组腺病毒，病毒滴度为1×10^9U／mL。结论：该重组腺病毒载体的成功构建，为进一步研究携带CCR7基因的imDC的趋化迁移性等研究提供了一定的工作基础。

肺腺癌组织中表皮生长因子表达与树突状细胞和调节性T细胞关系的研究

目的探讨肺腺癌组织中表皮生长因子(VEGF)表达与树突状细胞(DC)及调节性T细胞(Treg)的关系。方法选取2000年1月至2012年12月间行手术治疗的55例肺腺癌患者术后组织标本,以及其中16例患者的癌旁正常组织。采用免疫组化方法检测癌组织和癌旁组织中VEGF、CD1a(不成熟DC表达阳性)和CD4的表达情况,分析其与患者临床特征的关系。结果 16例肺腺癌组织中VEGF的表达明显高于癌旁正常组织,差异有统计学意义(P<0.05);癌组织中CD1a DC表达[(5.59±3.71)%]明显高于癌旁正常组织[(1.39±0.61)%],差异有统计学意义(P<0.05)。癌组织中CD4T细胞阳性比例[(6.62±4.27)%]显著高于癌旁正常组织[(0.43±0.46)%],差异有统计学意义(P<0.05)。55例肺腺癌患者癌组织中,VEGF阳性45例,阳性率为81.8%。VEGF阴性和阳性患者中CD1a+DC表达差异无统计学意义(P>0.05),VEGF阴性和阳性患者中CD+4细胞表达差异无统计学意义(P>0.05)。CD1a+DC与CD4+细胞比例呈正相关(r=0.306,P=0.01)。CD1a和CD4的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移情况无关。结论肺腺癌组织中VEGF、不成熟DC和Treg在癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。不成熟DC和Treg数量与VEGF表达无关,而不成熟DC数量与Treg数量呈正相关。