大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的分泌表达与性质鉴定

目的 较高效率分泌表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位并鉴定其性质。方法 将编码成熟大肠杆菌不耐热肠毒素 (LTB)的基因引入pET2 2b(+)并转化E .coliBL2 1(DE3) ;重组工程菌在改良M9 CAA培养基内进行表达 ;对分泌表达的LTB进行纯化后进行神经节苷脂 (GM1)结合活性、免疫原性与黏膜免疫佐剂活性的鉴定。结果 LTB既能分泌表达至胞周质又能以包含体形式表达 ,两者都与pelB信号肽准确分离。纯化出的LTB具有正常的GM1结合活性、免疫原性及黏膜免疫佐剂活性。结论 pET2 2b(+)质粒的pelB信号肽可使LTB以较高效率分泌表达。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐剂作用

目的优化重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达条件,并检测其黏膜佐剂作用。方法通过向LB培养基中添加葡萄糖(终浓度为0.5%)、低温培养诱导等方法诱导LTB的表达;采用阳离子交换法对目的蛋白进行纯化;以LTB作为佐剂进行免疫试验。结果可溶性重组大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的表达量明显提高,纯化后蛋白含量达95%以上,经纯化的LTB作为三价流感裂解疫苗或gD抗原的佐剂免疫BALB/c小鼠,可提高小鼠血清及黏膜的抗体水平,且其效果与铝化剂及福氏佐剂相当或更高。结论优化了LTB的表达条件,且表达的LTB具有较强的黏膜免疫佐剂作用。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达及初步纯化

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂活性。从大肠杆菌中调出LTB的原始基因,将该基因克隆、构建pET21b-LTB表达载体、转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并对表达产物进行初步纯化;经DNA测序、SDS-PAGE、ELISA检测,结果表明成功构建了能够稳定表达可溶性LTB的菌株,并获得初步纯化LTB的方法。为今后LTB的研究及应用奠定了基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

目的 研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因工程菌的发酵工艺。方法 先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件 ,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件 ,并进一步对发酵工艺进行改良优化。结果 经试验确定了rLTB基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合 ,优化后工程菌菌体产量平均可达 40 5g/L ,目的蛋白的表达率平均为 3 0 6%。结论 建立了稳定、高效的工程菌发酵工艺。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合表达载体的构建及应用

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的融合表达载体。方法 PCR扩增LTB基因 ,并在其 3′端去掉终止密码子 ,引入编码TAPI接头 ,通过EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切位点重组于PinpointXa Ⅰ载体上 ,将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合 ,转化E .coliJM10 9,SDS PAGE及Westernblotting分析其表达。结果 成功构建了LTB融合表达质粒 ,并获得了幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合表达。结论 LTB融合表达载体的成功构建为研究分子内佐剂疫苗奠定了实验基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌中的分泌表达

以大肠杆菌和乳酸菌穿梭表达型载体pMG36e为基本模型,采用重叠延伸PCR方法拼接相关调控元件构建一种乳酸杆菌组成型分泌表达载体;将编码LTB蛋白的eltb基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体中,构建重组质粒pMG36e-UP/L-LTB,电转化于干酪乳杆菌393中,筛选获得重组干酪乳杆菌,应用western blot方法鉴定LTB表达情况。Western-blot分析显示,约有12 KDa的目的蛋白以分泌形式表达,可被LTB阳性血清识别。表明LTB蛋白在重组干酪乳杆菌获得了表达,并且具有免疫反应活性和佐剂活性,为以LTB为分子佐剂研制乳酸菌黏膜疫苗奠定基础。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在鸭体内的吸收代谢及组织分布

研究重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(rLTB)在鸭体内的吸收代谢及组织分布,为rLTB的临床应用安全性提供依据。试验鸭分别肌注1,50,100 mg/kg rLTB后,以神经节苷脂GM1酶联免疫吸附法(GM1-ELISA)测定注射后不同时间点鸭血清中的rLTB含量;连续3次肌注rLTB后,观察临床症状和剖检病理变化,并采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑制备组织切片,HE染色观察组织病理学变化,免疫酶组织化学染色观察rLTB在各脏器内的分布及含量变化。结果表明:鸭血清中的rLTB含量变化及维持时间与rLTB注射剂量呈正相关。1 mg/kg注射组2 h达到峰值,维持至6 h开始下降,24 h后基本检测不到;50,100 mg/kg注射组分别于2 h和1 h达到峰值,并均维持至12 h才开始下降,48 h后基本检测不到。HE染色切片显示50 mg/kg注射组肝细胞轻度浊肿变性,肺脏轻微炎症;100mg/kg注射组肝细胞浊肿变性明显、肺脏重度炎症、脑组织出现局灶性坏死。免疫组化染色结果显示,在被检脏器中均检出rLTB,以大脑含量最高,脾脏和肝脏次之,心脏和肺脏检出量低。rLTB大剂量肌肉注射可引起鸭一定的组织学病变,对鸭的安全使用剂量应不超过50 mg/kg。

产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位可有效诱导和增强对肠道病毒71型的黏膜免疫应答

目的研究产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的免疫原性。评价肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白VP1联合LTB的鼻腔免疫效果。方法构建重组质粒pET32a-LTB,表达的6×His-LTB融合蛋白用Ni2+-NTA树脂纯化后免疫新西兰大白兔制备抗血清,ELISA检测抗血清效价。用纯化的EV71 VP1、LTB联合EV71 VP1、生理盐水分别经鼻腔免疫BALB/c小鼠,收集血清、肺和小肠黏膜冲洗液,采用间接ELISA检测IgG和分泌性IgA(sIgA)。结果已成功构建重组质粒pET32a-LTB。表达的6×His-LTB融合蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为30 000,免疫兔所制备的抗血清效价为1∶125 000。EV71 VP1联合LTB组的小鼠特异性IgG和sIgA水平较EV71 VP1单独免疫组和对照组有明显增高。结论在E.coli BL21(DE3)中成功表达了6×His-LTB融合蛋白,纯化的融合蛋白具有良好的免疫活性和佐剂活性。通过滴鼻免疫,LTB可有效增强特异性血清抗体反应,诱导黏膜免疫应答。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的表达、纯化及黏膜佐剂活性研究

目的 对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和黏膜佐剂活性分析。方法 应用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增出不耐热肠毒素B基因,将此构建于原核表达载体pET 11C,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,然后采用D(+) immobilizedgalactose亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以纯化后重组LTB为佐剂,与幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位蛋白(rUreB)共同口服和滴鼻免疫BALB c小鼠,分析重组LTB的黏膜佐剂活性。结果 PCR扩增出390 bp LTB基因,与GenBank公布的核苷酸序列的相似性为99.5%。重组LTB蛋白的表达率为6%,以胞周质分泌形式表达,经亲和层析后蛋白纯度大于95%。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性和良好的免疫原性及免疫反应性。动物试验表明,重组LTB与rUreB抗原共同口服和滴鼻免疫小鼠后的特异性血清IgG及鼻腔、气管、胃黏膜和小肠黏膜sIgA水平显著高于单独rUreB抗原免疫组(P<0.05)。结论 所获得的重组LTB具有较好的黏膜佐剂活性,为其在黏膜疫苗中的应用奠定基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定

目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%。重组菌诱导4h,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的25%。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位对鸭禽流感疫苗的免疫效果

从大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的生物安全性、对鸭的毒副作用以及对鸭禽流感疫苗免疫增强效果等方面进行研究,结果表明,LTB制品中未检测到自身编码基因和抗性标记基因残留;高剂量LTB能诱导产生抗LTB自身抗体,并与剂量呈正相关;当使用剂量增大至50 mg/kg时,试验鸭表现出一定的神经症状及组织学病变;肌肉注射1 mg/kg LTB可显著提高禽流感灭活疫苗免疫鸭的血凝抑制(HI)抗体滴度。研究表明LTB具有增强禽流感疫苗免疫效果的潜力,且对鸭的安全使用剂量不超过50 mg/kg。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达、纯化及其黏膜免疫佐剂作用

目的原核表达、纯化大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),并评价其黏膜免疫的佐剂作用。方法从产毒素大肠杆菌44815菌株中扩增出LTB基因,克隆至质粒pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-LTB,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达的LTB经纯化后进行神经节苷脂GM1结合活性及黏膜免疫佐剂活性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组LTB主要为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的15%;纯化的LTB纯度可达95%以上,可与兔抗CTB血清发生特异性反应,且具有GM1结合活性及良好的黏膜免疫佐剂活性。结论在大肠杆菌中成功表达了重组LTB蛋白,纯化的LTB具有良好的黏膜免疫佐剂活性。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌β_1、β_2毒素融合基因的构建及表达

为了构建含大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与产气荚膜梭菌β1、β2毒素融合基因的表达菌株,试验将亚克隆LTB基因融合到β2-β1毒素基因的上游,构建了pET30a-LTB-β2-β1原核表达载体,经IPTG诱导表达,对其表达产物进行SDS-PAGE检测和Western-blot分析。结果表明:重组菌株可以表达LTB-β2-β1融合蛋白,且该融合蛋白可以被相应的抗体识别。

产肠毒素大肠杆菌K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位的原核表达及其鼻腔免疫效果

目的原核表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)b亚单位(LTb),并评价其鼻腔免疫效果。方法采用PCR技术分别扩增不含信号肽的K88和LTb基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达的重组K88和LTb蛋白纯化、复性后,进行SDS-PAGE分析。分别用K88单独、K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠,以生理盐水作为对照,每次间隔1周,共4次,末次免疫后10 d,分离血清,并收集鼻腔和小肠黏膜冲洗液,间接ELISA法检测各组血清特异性IgG和黏膜sIgA抗体水平。结果重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组K88和LTb蛋白相对分子质量分别为28 100和12 500,表达量分别约占菌体总蛋白的35%和40%,主要以包涵体形式存在;纯化复性后的重组蛋白纯度均可达95%以上。K88联合LTb滴鼻免疫组血清特异性IgG及鼻腔、小肠黏膜冲洗液中特异性SIgA水平均较K88单独免疫组和对照组明显增高,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论在大肠杆菌中高效表达并纯化了重组K88和LTb蛋白,K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠后,可增强特异性血清抗体反应,且诱导了黏膜免疫应答,为将来开发新型的ETEC基因工程疫苗奠定了基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位作为黏膜免疫佐剂的研究

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的组成部分之一,具有免疫原性,但无毒性,是一种较为理想的黏膜免疫佐剂。本文就大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的分子结构、介导的免疫反应及其黏膜免疫佐剂效应作一综述。

大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚基的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚基(heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),并制备其多克隆抗体。方法利用PCR技术扩增LTB基因,并将其连接至pET30a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pET30a(+)-LTB-8×His,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对目的蛋白表达条件进行优化。利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,免疫大耳白家兔制备兔源抗LTB多克隆抗体。结果重组原核表达质粒pET30a(+)-LTB-8×His经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组LTB蛋白相对分子质量约为13000,以包涵体形式表达,最佳诱导条件为:用0.4 mmol/L IPTG于30℃诱导4 h;纯化后蛋白浓度为3.7 mg/m L;制备的多克隆抗体可用于LTB的Western blot及IFA检测。结论利用大肠埃希菌表达系统成功表达了重组LTB蛋白,并制备了具有良好反应原性和特异性的多克隆抗体,为产肠毒素型大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)疾病的诊断及LTB黏膜免疫佐剂特性的研究奠定了基础。

淋球菌nspA和大肠杆菌ltB融合基因的构建、表达及鉴定

通过基因工程的方法构建奈瑟氏淋球菌表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A,nspA)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin,ltB)融合基因的原核表达载体,对其进行表达与鉴定,为后续融合蛋白LTB-NspA的生物活性分析及其作为淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定基础。用PCR法从标准菌株分别扩增出nspA、ltB基因,用重组PCR法通过接头将ltB与nspA融合,将其插入pEG30a中,转入BL21中表达。经测序、SDS-PAGE和Western blot分析,证实成功构建了ltB-nspA融合基因的原核表达载体,并在BL21中表达。ltB-nspA融合基因的成功表达,为进一步研究其生物活性及淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定了一定基础。

Balb/c小鼠口服幽门螺杆菌疫苗rLTB-HspA的免疫应答

目的 研究幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A (rHspA)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)融合蛋白 (rLTB HspA)作为口服疫苗的免疫应答效果。方法 采用rLTB HspA口服免疫Balb c小鼠 ,ELISA分析小鼠血清、胃肠黏液中IgG、IgA抗体水平 ,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL 4、IFN γ的变化。结果 Balb c小鼠口服rLTB HspA能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。结论 Balb crLTB

猪圆环病毒2型Cap蛋白部分基因序列与大肠杆菌LTB成熟肽基因的融合表达及免疫原性研究

为了获得猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)衣壳蛋白(Cap)基因3’端396 bp的片段与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)成熟肽编码区融合基因的高效表达,并检验重组蛋白的免疫保护效果。以含PCV-2全基因组的pMDT PCV-2质粒为模板,用PCR的方法扩增PCV-2 Cap基因,并将其克隆到pET28a(+)中,构建得到pET-Cap质粒,利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切切下Cap基因3’末端396 bp的片段,插入到pET-LTB原核表达质粒LTB基因的3’末端,从而构建pET-LTB△Cap原核表达质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS后,用IPTG诱导重组菌,用SDS-PAGE电泳和Western blot检测诱导物。表达产物经初步纯化后用昆明系小白鼠做免疫保护实验。结果表明:pET-LTB△Cap重组融合表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白分子量约为29Ku,表达量约占菌体蛋白的36.67%,融合蛋白能被PCV-2阳性血清识别。攻毒后,所有小鼠临床表现正常。用PCR检测有1/8的免疫小鼠感染了PCV-2,而对照组8只小鼠都感染了PCV-21。PCV-2 Cap基因3’端396 bp的片段与LTB基因融合能实现高效表达,表达产物免疫的小白鼠可抵抗PCV-2的攻击此研究为PCV-2基因工程疫苗的研究奠定了基础。

抗淋病LTB-PorB核酸疫苗与蛋白疫苗联合应用增强免疫应答的研究

目的:初步探讨抗淋病LTB-PorB核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫的免疫增强效应,为研制抗淋病疫苗提供实验依据。方法:大量制备核酸疫苗(pcDNA3.1(-)/ltB-porB)及重组蛋白疫苗(rLTB-PorB);通过鼻饲途径将核酸疫苗和蛋白疫苗采用核酸初免-蛋白加强(DNAprime-protein boost)联合免疫以及分别单独免疫雌性BALB/c小鼠,同时设PBS及空质粒(pcDNA3.1(-))对照组,检测各组体液免疫和细胞免疫应答水平。结果:免疫后第56天,联合免疫组小鼠生殖道sIgAA450(1·083±0·179)、血清IgG A450(1.023±0.116)、脾淋巴细胞诱生的IL-4[(357.58±34.44)/pg/ml]和IFN-γ[(261.85±29.92)/pg/ml]水平均明显高于各对照组(P<0.01),小鼠脾淋巴细胞增殖率(SI:2.12±0.29)较对照组显著增高(P<0.05);核酸疫苗组、蛋白疫苗组和联合免疫组血清IgG亚类IgG2a/IgG1比值分别为1.678、0.455和0.693。结论:LTB-PorB核酸疫苗和蛋白疫苗联合免疫组诱导的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答水平明显优于单独的核酸疫苗组和蛋白疫苗组,且以诱导Th2倾向性免疫应答为主。