SAMHD1通过调控p27表达抑制肝细胞癌细胞增殖的研究

背景与目的:不育α基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domain-containing protein 1,SAMHD1)具有抑制多种肿瘤细胞生长的作用,但其调节肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞增殖的作用及机制尚未见报道。探究SAMHD1调控p27的表达对HCC细胞Huh7的增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法:首先通过蛋白质印迹法(Western blot)检测正常肝细胞和不同类型HCC细胞中SAMHD1的表达情况。利用基因修饰技术构建过表达SAMHD1、dNTP酶活性位点突变体(SAMHD1-D207N)和磷酸化位点突变体(SAMHD1-T592E)的重组质粒,然后利用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测过表达SAMHD1及其突变体或siRNA干扰沉默SAMHD1对HCC细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡情况。在癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中分析SAMHD1和p27表达的相关性。结果:HCC细胞中SAMHD1表达上调,过表达SAMHD1、SAMHD1-D207N和SAMHD1-T592E可以抑制Huh7细胞增殖,细胞周期停滞在G1/G0期;相反,干扰SAMHD1后细胞增殖加快,细胞周期停滞在G2/M期。机制研究表明,SAMHD1上调细胞周期蛋白激酶抑制因子p27的表达。在HCC组织中,p27的表达与SAMHD1表达呈正相关。结论:过表达SAMHD1可以上调p27的表达,导致细胞周期停滞在G1/G0期,从而抑制HCC细胞增殖,这种抑制作用不依赖于其dNTP酶活性和磷酸化修饰。

HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA表达变化及其与血浆IFN-α水平的相关性

目的观察人类免疫缺陷病(HIV-1)感染者外周血单个核细胞(PBMC)中不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(SAMHD1)mRNA变化及其与血浆干扰素(IFN-α)水平的相关性。方法 HIV-1感染者78例,其中32例未接受抗病毒治疗(未治疗组),46例接受高效抗逆转录病毒治疗1 a以上(治疗组),另选28例健康体检者作对照(对照组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测PBMC中SAMHD1 mRNA,采用人IFN-αELISA检测试剂盒检测血浆IFN-α,采用Pearson相关分析法分析HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA与外周血IFN-α水平的相关性。结果与对照组比较,未治疗组和治疗组PBMC中SAMHD1 mRNA、外周血IFN-α水平升高(P均<0.01);与未治疗组比较,治疗组HIV病毒载量降低,CD+4T细胞数增加(P均<0.05)。HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA与病毒载量、CD+4T细胞数量无相关性(r分别为-0.306、0.064,P均>0.05),与血浆IFN-α水平呈正相关(r=0.324,P<0.05)。结论 HIV-1感染者外周血PBMC中SAMHD1 mRNA升高,其与外周血IFN-α水平相关;HIV-1的感染会上调SAMHD1 mRNA水平,其机制可能是通过IFN-α的调节实现的。

灵长类动物限制性因子SAMHD1的生物学功能分析

目的:探讨不同灵长类动物限制因子不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)的抗病毒、抑制逆转录转座子LINE-1和减弱干扰素(IFN)产生信号通路等作用,为灵长类动物SAMHD1的研究提供依据。方法:构建稳定表达不同灵长类动物SAMHD1蛋白的U937细胞系,以空载体构建的细胞作为阴性对照组,以稳定表达不同灵长类动物SAMHD1蛋白的U937细胞系为实验组。经佛波酯(PMA)刺激分化成巨噬样细胞后,流式细胞术分析各组HIV-1病毒感染率。以单独转染SAMHD1表达质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染SAMHD1与HIV-2/SIV Vpx表达质粒的细胞为实验组,转染后48h收获细胞,采用Western blotting法检测SAMHD1蛋白表达水平,免疫荧光检测法观察不同SAMHD1蛋白的细胞内定位。以单独转染LINE-1-GFP报告质粒的HEK293T细胞作为对照组,以共同转染LINE-1-GFP与SAMHD1表达质粒的细胞为实验组,采用流式细胞术检测GFP阳性细胞率,代表SAMHD1对LINE-1转座子的活性。以单独转染IFN-luc报告质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染IFN-luc和SAMHD1表达质粒的细胞为实验组,采用化学发光仪检测HEK293T细胞中荧光素酶的表达水平。结果:与阴性对照组比较,灵长类动物SAMHD1稳定表达的实验组HIV-1病毒感染率明显降低(P<0.01)。与对照组比较,实验组灵长类动物SAMHD1蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。免疫荧光检测,灵长类动物SAMHD1蛋白均定位于细胞核中。与对照组比较,实验组GFP阳性细胞率明显降低,即SAMHD1对LINE-1转座子活性降低(P<0.05或P<0.01)。与对照组比较,实验组灵长类动物HEK293T细胞中荧光素酶表达水平明显降低(P<0.05)。结论:不同灵长类动物SAMHD1蛋白具有抵抗HIV-1病毒感染、抑制逆转录转座子LINE-1以及拮抗天然免疫系统产生IFN的作用。