不同表达条件对Eimeria tenella丙二酰单酰辅酶A:ACP转移酶活性的影响

为探讨不同原核表达载体、不同表达温度对重组表达Eimeria tenella丙二酸单酰辅酶A:ACP转移酶活性的影响,以生物信息学技术预测的E.tenellaⅡ型脂肪酸合成代谢途径中的丙二酰单酰辅酶A:ACP转移酶(Et-MCAT)编码序列为基础,分别设计引物扩增完整ORF,采取截除信号肽而保留转导肽以及切除信号肽和转导肽的不同策略,选择pMAL-c2x、pET-32a(+)和pProExHTa3种不同表达载体分别构建重组表达质粒,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)后,在不同条件下诱导表达,利用酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性,以评价不同表达策略对表达效果和表达产物活性的影响。表达水平和酶活性分析结果显示,惟切除信号肽和转导肽后的功能蛋白编码区能表达,Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-mcat体系的可溶性表达量高于Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-mcat,但二者表达产物的酶活性相似,且均随着诱导温度的降低其可溶性蛋白表达量增加。但Rosseta(DE3)/pProExHTa-mcat体系仅能表达不溶性蛋白,且复性后无酶活性,改变诱导温度对表达效果无明显影响。结果表明不同表达载体和诱导温度对大肠杆菌所表达EtMCAT的活性及其表达形式有显著影响,其中融合标签和表达温度可能是主要的影响因素,包涵体表达的重组酶即使复性处理仍难达到酶活性分析的要求。

顶复门原虫与细菌Ⅱ型丙二酰单酰辅酶A:ACP转酰基酶研究进展

大部分顶复门原虫与人畜重要寄生虫病密切相关。近年来,由于各类药物在寄生虫与细菌病防治中的广泛应用,甚至是滥用,造成了这类寄生虫与细菌的严重抗药性,急需一些新型抗感染性药物的出现。由于在一些顶复门原虫与细菌中广泛存在的Ⅱ型脂肪酸代谢途径在其脊椎动物宿主中并不存在,而丙二酰单酰辅酶A:ACP转酰基酶(malonyl-CoA:ACP transacylase,MCAT)是由mcat基因编码的一种巯基酶,负责在起始步骤把丙二酰基团从丙二酰单酰CoA上的硫酯连接部位转移到ACP的磷酸泛酰巯基乙胺臂上而形成丙二酰单酰ACP,对于顶复门原虫和细菌的脂肪酸合成代谢至关重要,成为研究开发药物的理想靶位。文章对ACP转酰基酶的研究进展进行了综述。

油茶丙二酰单酰CoA:ACP转酰基酶基因的克隆与原核表达

【目的】油茶种仁含油率较低且易遭逆性环境等的影响,这些都严重影响和制约了油茶产业的快速发展。丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶是脂肪酸合成酶(FASⅡ)复合体的组成酶之一,在脂肪酸合成中起着装载作用,它的酶促反应产物丙二酰单酰ACP是脂肪酸合成关键组成部分。开展该基因的功能研究,能为油茶的分子遗传育种奠定基础。【方法】以油茶品种‘华硕’种子为材料,借助其种子转录组和表达谱数据库,通过RACE技术,克隆丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因并对该基因进行生物信息学分析。利用常规的酶切连接技术构建基因的原核表达载体,并利用α酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性。【结果】丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因的全长c DNA 1 867 bp,含有1 131 bp的开放读码框,编码376个氨基酸,具有58个氨基酸长度的叶绿体转运肽,该基因被命名为Co MCAT(Gen Bank登录号KJ910337)。在malonyl-Co A结合位点和ACP结合位点上分别存在高度保守的基序"GQGXQ"和"GXSXG"。原核表达载体p ET30a-Co MCAT在BL21(DE3)细胞中被成功地诱导表达,目的重组蛋白分子量约为40 k Da。酶活性分析表明,重组蛋白Co MCAT的最佳催化温度为30℃,最佳p H为7.0,比酶活性约为2.384 U·μg-1。【结论】以本实验室构建的油茶转录组数据库为基础,首次克隆获得油茶MCAT基因的全长c DNA序列,构建其原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达目的蛋白,并对重组蛋白进行初步的酶活性分析。研究结果为今后进一步深入开展和揭示油茶MCAT基因在油脂合成的代谢过程中的作用奠定基础。

油桐丙二酰单酰CoA:ACP转酰基酶的克隆与序列分析

为了深入了解油桐丙二酰单酰辅酶A酰基载体蛋白转酰基酶(Malonyl Co A:ACP transacylase,MCAT)在油脂合成代谢过程中的作用,利用RT-PCR技术克隆获得了油桐MCAT基因序列,且命名为Vf MCAT,并利用相关生物软件对该基因序列及其相应蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明:Vf MCAT的CDS长为1 179 bp,编码392个氨基酸;该蛋白与蓖麻和亚麻的MCAT同源性均达85%,存在"GXSXG"和"GQGXQ"两个高度保守的motif,在系统进化关系上,其与蓖麻和亚麻的亲缘关系最为接近;分析其氨基酸序列后发现,Vf MCAT的分子量约为41.67 KDa,理论等电点p I为8.43,是一个含有一个跨膜结构域的可溶性稳定蛋白;对其二级和三级结构的预测结果表明,该蛋白主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,且最有可能在线粒体中发挥其主要作用,文中由此推测,Vf MCAT在叶绿体中参与了油桐脂肪酸合成代谢。

花生丙二酰单酰CoA转酰基酶(MCMT)基因家族应对不同胁迫的响应模式

丙二酰单酰CoA:ACP转酰基酶(malonyl-CoA:ACP malonyltransacylase,MCMT)催化由丙二酰单酰CoA形成丙二酰单酰ACP。它既是生物脂肪酸合成的基本构成要素,又是细胞膜、储藏油脂和脂信号分子的重要成分。本文就花生MCMT基因家族成员的各项特征做了系统分析。结果表明,栽培花生基因组中共有5个AhMCMTs基因,分别位于5条不同的染色体上。这5个AhMCMTs均含有较多的内含子,数目为9~12个。蛋白长度从277到472个氨基酸不等,且均无跨膜结构,都定位于叶绿体中。有3个AhMCMTs具有可变剪接现象,其中arahy.FJ253B和arahy.R7F6LC各有6个剪接体,arahy.T9C115有2个剪接体。可变剪接类型以内含子滞留、外显子跳跃和发生在5’-UTR的可变剪接为主。通过进化树分析发现,栽培花生与油菜、山茶和羽扇豆基因组中含有较多的MCMT基因,可能是发生了基因家族扩张现象。根据花生转录组数据发现它们的组织特异性表达模式显著不同,arahy.FJ253B表达量最高,几乎在所有组织器官中均有表达,推测是花生生长发育的主要作用基因。它们应对不同胁迫处理的反应模式也各不相同,并且同一个基因在相同胁迫处理下,在根中和叶中的反应模式也不同,显示出这5个AhMCMT基因应对不同胁迫处理时的不同分工。

三角褐指藻丙二酰单酰辅酶A:酰基载体蛋白转酰基酶的功能分析

【背景】丙二酰单酰辅酶A:酰基载体蛋白转酰基酶(malonyl coenzyme A:acyl carrier protein transacylase,MCAT)是Ⅱ型脂肪酸合酶(fatty acid synthaseⅡ,FASⅡ)的重要亚基,与脂肪酸合成直接相关,然而关于微藻MCAT的信息却很少。【目的】验证三角褐指藻MCAT的功能。【方法】在模式硅藻三角褐指藻的全基因组序列中发现了一个可能的mcat基因序列,对其进行生物信息学分析,构建原核表达载体,并转入MCAT缺陷型大肠杆菌L48菌株中,最后利用GC-MS分析突变株脂肪酸的成分和含量。【结果】三角褐指藻MCAT主要结构为α-螺旋和无规则卷曲,与圆柱脆杆藻的亲缘关系最为接近,为protits型MCAT;三角褐指藻MCAT的表达使MCAT缺陷型大肠杆菌L48菌株恢复了合成脂肪酸的功能;对L48回复突变株的脂肪酸组成进行分析,发现该酶对C14:0具有底物偏好性,从而促进中长链脂肪酸如C16:0和C17:1的合成,这一特点与protits型MCAT的特性基本相符。【结论】三角褐指藻MCAT能促进脂肪酸的合成,这为微藻脂肪酸合成及代谢调控研究提供了新的线索,有利于微藻脂质的研究和应用。

乙酰辅酶A羧化酶反义寡核苷酸对非酒精性脂肪肝细胞模型的作用

目的观察乙酰辅酶A羧化酶(ACC)反义寡核苷酸(ASODN)对HL-7702肝细胞脂肪变性的影响。方法用计算机软件设计并合成特异性靶向ACC的硫代修饰ASODN。用静脉脂肪乳剂体外培养正常HL-7702肝细胞48 h,制备体外脂肪肝细胞模型。以脂质体法将ACC-ASODN转染至脂肪肝细胞模型,设置空白组(HL-7702肝细胞组)、模型组(脂肪肝细胞模型组)、低高2个浓度实验组(5,10μmol·L^(-1)ACC-ASODN转染组)。以ACC-ASODN转染入脂肪肝细胞模型24 h后,放射性同位素技术测定ACC酶活性,HPLC法测定丙二酰辅酶A含量,放射性同位素技术测定肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ(CPT I)活性,用全自动生化分析仪测定4组肝细胞内三酰甘油(TG)含量。结果 ACC-ASODN转染入脂肪肝细胞模型24 h后,空白组、模型组及低、高2个浓度实验组的肝细胞ACC活性(U)分别是0.74,0.33,0.20,0.18;这4组的细胞内丙二酰辅酶A含量(nmol·L^(-1))分别是14.3,12.4,7.5,6.8;这4组的细胞CPTⅠ活性(U)分别是1.33,1.47,3.85,3.95;这4组的TG含量分别是0.20,0.52,0.37,0.28 mmol·L^(-1)。模型组与空白组的以上几项指标比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);实验组与模型组的以上几项指标比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论 ACC-ASODN作用于肝细胞,通过抑制肝细胞ACC活性,使TG含量下降,从而减轻肝细胞脂肪变性。

黑逍遥散对老年性痴呆的防治作用及其机制研究

目的观察黑逍遥散对AD模型小鼠学习记忆能力、抗氧化能力及中枢神经递质活性的影响,探讨黑逍遥散防治AD的作用及其机制。方法 ip氢溴酸东莨菪碱复制AD小鼠模型,用黑逍遥散组、逍遥散组进行对抗治疗,第47天测试其记忆能力。然后取脑组织,测定小鼠脑组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)及单胺类氧化酶(MAO)含量。结果黑逍遥散组、逍遥散组均可提高小鼠学习记忆能力,降低潜伏时间;提高脑组织匀浆SOD活性,降低MDA含量;显著升高小鼠脑组织匀浆ChAT、MAO活性,降低AchE活性,以黑逍遥散组最为明显。结论黑逍遥散能较好地改善AD模型小鼠学习记忆能力,可能与对抗自由基氧化、调节中枢胆碱能神经元和单胺类神经元活性有关。

MICT/HIIT对高脂膳食大鼠心肌和比目鱼肌超微结构的影响及机制探讨

目的:观察中等强度持续运动(MICT)与高强度间歇运动(HIIT)对高脂膳食大鼠心肌和比目鱼肌超微结构的影响并探讨其机制。方法:5周龄雄性SD大鼠随机分为普通膳食安静组(C)、高脂膳食安静组(F)、高脂膳食MICT组(M)和高脂膳食HIIT组(H),每组8只,高脂膳食饲料脂肪含量为45%。M和H组进行12周坡度为25°的跑台运动,M组进行70%VO_(2)max强度的持续运动,H组进行以5 min 40%~45%VO_(2)max和4 min 95%~99%VO_(2)max强度依次交替的间歇运动。干预结束后检测血清FFA、TG、HDL、LDL含量;透射电镜观察大鼠心肌和比目鱼肌超微结构;Western blot检测心肌和比目鱼肌AMPK、MCD及CPT-1的蛋白表达。结果:与C组比较,F组大鼠体重、Lee`s指数、血清LDL、TG和FFA含量均增加,HDL含量降低(P<0.05);心肌和比目鱼肌AMPK、CPT-1蛋白表达升高,MCD蛋白表达降低(P<0.05),超微结构损伤。与F组比较,M、H组大鼠体重、Lee`s指数降低、血清LDL、FFA含量降低(P<0.01);心肌AMPK、MCD、CPT-1蛋白表达增加,比目鱼肌AMPK、MCD蛋白表达增加(P<0.05),超微结构损伤减轻。与M组比较,H组大鼠血清HDL含量增加(P<0.01),心肌AMPK、MCD蛋白表达增加,超微结构损伤较轻;比目鱼肌AMPK蛋白表达降低,MCD蛋白表达增加(P<0.05),超微结构损伤较重。结论:MICT与HIIT可通过干预AMPK、MCD、CPT-1蛋白表达,对高脂膳食大鼠心肌和比目鱼肌超微结构产生不同影响。