裂殖壶菌丙二酸单酰转移酶(MAT)基因的克隆与序列分析

二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的多不饱和脂肪酸,裂殖壶菌(Schizochytrium)因富含DHA成为当前的研究热点。丙二酸单酰转移酶(MAT)是该菌合成DHA的关键酶。以Schizochytriumsp.FJU-512cDNA文库中的EST序列contig417(GenBank accession No.EF483907)为基础,获得了丙二酸单酰转移酶基因的DNA序列和cDNA序列。序列分析表明,cDNA序列与DNA序列完全一致,开放阅读框全长1 176bp,编码391个氨基酸,且具备该类酶氨基酸序列的两个经典保守区。对该蛋白进行系统发育分析,构建进化树,结果显示,该蛋白同Schizochytriumsp.TIO01的丙二酰辅酶A-ACP转移酶(MCAT)亲缘关系最近。

西农萨能羊乙酰/丙二酸单酰基转移酶基因重组腺病毒载体的构建

本研究旨在通过构建西农萨能羊脂肪酸合酶(FASN)基因乙酰/丙二酸单酰基转移酶(MAT)区域的重组腺病毒载体,为研究其在奶山羊乳腺上皮细胞中过表达以及功能和作用机制做准备。根据GenBank收录的西农萨能羊MAT序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上并线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasyⅠ的E.coli Bj5183感受态细胞进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAd-MAT-HIS,并用PacⅠ酶切鉴定,将经过PacⅠ线性化的pAd-MAT-HIS转染HEK 293细胞进行病毒包装和扩增,用LaSRT法测定病毒滴度。将本次克隆的MAT序列与GenBank收录的山羊序列对比发现,在601bp处碱基由G转变为A,导致氨基酸序列由丙氨酸(Ala)201转变为苏氨酸(Thr)201。酶切鉴定、绿色荧光蛋白观察、PCR及Western blot检测均证明,重组腺病毒质粒构建成功,病毒滴度为2×109 PFU.mL-1。本研究成功构建了重组腺病毒pAdEasy-MAT-HIS。

野油菜黄单胞菌BioC蛋白的生物信息学分析

野油菜黄单胞菌ATCC 33913基因组中Xcc0383、Xcc1678被标注丙二酸单酰-ACP甲基转移酶(BioC)编码基因,从KEGG数据库检索Xcc0383和Xcc1678的氨基酸序列,运用生物信息学在线分析软件对这2个基因编码的蛋白进行了理化性质、蛋白结构、亲水性、跨膜结构、信号肽、磷酸化位点及蛋白相互作用网络的预测分析。结果表明2个蛋白理化性质相近,但Xcc0383为亲水性蛋白,Xcc1678位疏水性蛋白。2个蛋白都具有甲基转移酶功能结构域,不存在跨膜结构域和信号肽,磷酸化位点和翻译后修饰位点的数量和位置类似。Xcc0383和Xcc1678二级结构中组成最多的是α-螺旋,分别占46.36%和51.69%,三级结构预测结果与二级结构一致。蛋白相互作用预测后发现,Xcc0383与BioH、BioF、BioA等负责生物素合成的蛋白关系最为密切,而Xcc1678与其毗邻的糖基转移酶关系密切。氨基酸序列同源比对显示Xcc0383与大肠杆菌(E.coli)的BioC相似性较高。Xcc0383编码蛋白负责在野油菜黄单胞菌体内合成生物素,而Xcc1678作为甲基转移酶负责为不同的受体分子提供甲基基团。