应用抑制性消减杂交技术克隆筛选丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建新基因丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2(HCVFBP2)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVFBP2反式激活相关基因。方法:以HCVFBP2表达质粒pcDNA3.1(-)FBP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEMTeasy载体连接,构建cDNA消减文库,转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果:成功构建人类新基因HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后选取48个克隆,进行菌落PCR分析,均得200～1000bp插入片断。挑取30个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得28个已知功能基因序列和2个未知功能基因。结论:应用SSH技术成功构建了HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为阐明HCVFBP2生物学功能提供理论依据。

A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活基因2(FTP2)的原核表达载体并诱导其表达,制备多克隆抗体并探讨其在临床病理组织中表达的意义。方法通过PCR获得HCVFTP2基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)上,构建重组表达载体,在大肠埃希菌BL21中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blotting验证后进行大量表达并纯化。将纯化的重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,并将此抗体作为诊断试剂观察其在正常肝组织和临床病理组织中的表达情况。结果以pET32a(+)-FTP2表达载体转化BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得大量重组蛋白,分子量约为25kD。将此重组蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,经抗体间接ELISA检测证明,多克隆抗体效价>1:128000,免疫组化显示多克隆抗体能够与丙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌等临床病理组织产生FTP2抗原反应。结论成功表达了HCV的FTP2蛋白并制备了其多克隆抗体,证实FTP2与丙型肝炎、肝硬化的发病机制密切相关。

丙型肝炎病毒E2结合蛋白1结合蛋白的酵母双杂交筛选研究

目的 应用酵母技术筛选丙型肝炎病毒 (HCV) 7包膜蛋白E2结合蛋白 1(E2BP1)的结合蛋白。方法 应用酵母双杂交系统 3 ,构建E2BP1诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合 ,于涂有x α gal营养缺陷型培养基 (SD/ Trp Leu His Ade)上筛选生长 ,对于阳性克隆的插入基因片段序列进行测定 ,并进行生物信息学分析。结果 5 3个阳性克隆测序 ,结果与GenBank数据库进行初步比较。其中 6个克隆为未知功能基因 ,其余 47个均与己知基因的序列高度同源 ( 90 %～10 0 % )。这 47个己知基因包括人类酶原颗粒蛋白 16、人类染色体序列、人类乙酰辅酶A转乙酰酶 1(ACAT1)、人类 4 羟基苯丙酮酸二加氧酶、人类硒蛋白P1(SEPP1)、人类组织蛋白酶F(CTSF)、人类prosaposin(PSAP)、人类金属硫蛋白 2A等 16种。

丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白1基因的克隆化与序列分析

目的对命名为F蛋白结合蛋白1(FBP1)的未知基因,克隆其全长基因并进行生物信息学分析。方法应用酵母双杂交技术得到FBP1,应用分子生物学技术克隆FBP1的基因编码序列。结果经酶切和测序鉴定,结果完全正确,成功克隆了FBP1的基因编码序。结论FBP1通过与F蛋白结合,在病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用过程中发挥重要作用。

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2基因在酵母细胞中的表达

目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活蛋白2(HCVFTP2)的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCVFTP2基因。方法以HepG2细胞来源的mRNA作为模板,经过逆转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增HCVFTP2基因,克隆到pGEMT载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和Westernblot免疫印迹分析。结果成功构建HCVFTP2基因酵母表达载体,Westernblot免疫印迹显示HCVFTP2基因在酵母细胞中表达成功。表达产物相对分子质量27kD。结论HCVFTP2在酵母中表达成功。

丙型肝炎病毒F蛋白对p21基因的调节作用

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白对细胞p21基因转录、表达的影响。方法PCR扩增HCV 1b来源的F基因,克隆至pcDNA3.1真核表达载体。F基因质粒转染HepG2细胞,48h后抽提细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR及Western blot检测p21基因表达变化。结果HCV F蛋白在HepG2细胞内瞬时表达,相对于空载体对照(目标基因表达量为1),HCV F基因质粒转染细胞的p21转录水平为3.2,蛋白表达水平为1.4。结论HCVF蛋白增加p21转录和表达,其生物学效应值得进一步研究。

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法:以HCVF蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCVF蛋白反式激活作用的新的靶基因。结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RTPCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCVFTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522。HCVFTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成。结论:HCVF蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌。HCVF反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCVF蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。

丙型肝炎病毒核心蛋白、Bcl-2、P21^(waf1)在丙型肝炎中的表达及相互关系

目的 调查丙型肝炎、肝硬化病人组织中的丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白、P2 1、Bcl 2的表达以及相互间关系 ,探讨HCV核心蛋白是否抑制P2 1和促进Bcl 2表达。方法 收集 2 3例HCV表达阳性的肝炎、肝硬化组织 ,采用免疫组化Envision法检测核心蛋白、P2 1、Bcl 2表达 ,并用统计学方法分析三者间的表达关系。结果 HCV核心蛋白和突变P2 1的阳性表达主要位于细胞核中 ,Bcl 2的阳性表达主要位于细胞质 ;HCV核心蛋白表达阳性组织中 ,P2 1阳性表达率仅 13 % ,Bcl 2阳性表达率则达 95 .7% ,三组间比较差异有显著性 (P =0 .0 12 )。HCV核心蛋白和Bcl 2二组间比较差异无显著性 (P =0 .5 61) ;HCV核心蛋白与Bcl 2、p2 1阳性强度两者间P值分别为 0 .0 12和 0 .2。结论 三种蛋白的表达有相关性 ,HCV核心蛋白可能促进Bcl 2蛋白的表达 ,抑制P2

丙型肝炎病毒NS2蛋白在Huh-7细胞中抑制NF-κB活性

将丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS2基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3.1(-)CMV启动子下游,构建成重组质粒pCNS2.用脂质体LipoVecTM转染Huh-7细胞,转染细胞内可检出NS2的mRNA和蛋白质,表明构建的pCNS2可在Huh-7细胞内成功表达;把不同剂量的pCNS2质粒DNA与报告质粒pNF-κ B-Luc共转染Huh-7细胞,48h后检测荧光素酶活性,结果显示与pCNS2共转染的细胞中pNF-κ B-Luc表达出的荧光素酶的活性比对照细胞降低了约2～4倍,并呈明显的剂量相关性.表明HCV NS2对NF-κ B激活转录活性有明显的抑制作用.这可能与HCV慢性持续性感染的致病性有一定的相关性.

筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因

细胞内蛋白 蛋白的结合是丙型肝炎病毒 (HCV)与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白 5A(NS5A)被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子 ,参与HCV的复制、转录和信号传导等过程 ,但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系 ,作者采用酵母双杂交系统 3,在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选 ,得到 35个与NS5A特异性结合的阳性克隆 ,包括载脂蛋白、线粒体单体型基因、磷脂酸酸性磷酸酶等 11种已知功能蛋白质基因和 3个未知功能基因。

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析

目的:筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白基因,并对新基因转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制。方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为“诱饵(bait)”,筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因。应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)基因的全长编码序列,并构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6。应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测。结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,确定人的HCBP6基因由456 nt组成,编码152 aa的蛋白。基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,HCBP6表达质粒转染的细胞有20条差异表达基因,其中13条基因表达增强,7条基因表达降低。这些差异表达的基因与细胞信号转导、增生、分化及生长调节密切相关。结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆蛋白结合蛋白的有效方法,基因表达谱芯片技术对于初步全面探索新基因的功能提供重要的资料。本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白与Hcbp6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据。

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因和蛋白的生物信息学分析

目的:克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合的肝细胞的蛋白基因,对新发现的基因及编码产物的结构与功能,及其基因表达的调节机制的结构基础进行生物信息学分析。方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为“诱饵(bait)”,筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因。应用生物信息学(bioinformatics)技术,对其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)全长基因及其编码产物的一级结构序列,进行生物信息学分析。获得该基因的基因组序列,并利用同源基因序列的比对,确定该基因在染色体上的定位,并确定人HCBP6基因的内含子序列。对其编码上游的基因组DNA序列进行分析,获得该基因启动子序列的一些信息。同时,根据同源基因序列的比较,确定了小鼠HCBP6的基因序列和氨基酸残基序列。通过对氨基酸残基序列的疏水性特点的分析,确定了HCBP6蛋白的潜在的抗原结构位点。通过蛋白质一级结构的在线计算机软件的分析,对人HCBP6蛋白质一级结构潜在的功能性结构位点进行了计算机辅助分析预测。结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,证实人HCBP6基因由456 nt组成,编码产物由152 aa组成。人HCBP6的基因组DNA是没有内含子序列的DNA结构。通过生物信息学技术分析,确定人HCBP6基因组DNA定位于人22号染色体上。在对人HCBP6基因启动子序列的生物信息学分析中发现了几段可能的启动子序列结构,以及可能的转录因子蛋白潜在的结合位点。利用同样的技术,确定了小鼠的HCBP6的基因序列和蛋白质一级结构序列。对人HCBP6的蛋白质一级结构序列进行分析,发现在其序列中第80-110氨基酸残基序列之间存在疏水性结构位点,提示抗原位点所在,对其进行免疫学分析提供了可能。利用在线软件,对人的 HCBP6蛋白质结构中潜在的功能位点进行了初步的预测,为进一步研究HCBP6蛋白的生物学功能的实验研究,提供了丰富的信息。这些生物信息学分析的结果,虽然目前还只是初步的,有些还不能被实验所证实,但是,对新基因的结构与功能的研究来说,毕竟这种生物信息学分析,能够提供一些线索,对下一步结构与功能分析实验的设计,具有很大的帮助。结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆、分析蛋白结合蛋白的基因,对于其功能结构域的预测的有效工具,在病毒性肝炎的致病机制研究中具有重要应用前景。

酵母双杂交技术筛选克隆丙型肝炎病毒NS3结合蛋白基因

为克隆与丙型肝炎病毒 (HCV)NS3蛋白结合的肝细胞中的蛋白基因 ,采用酵母双杂交系统Ⅲ技术进行筛选。构建HCVNS3蛋白诱饵酵母质粒 ,转化酵母AH10 9后与含文库质粒的酵母Y187进行配合 ,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。选择既能在 4重营养缺陷培养基(SD/ Trp Leu Ade His)上生长 ,又能在涂有X α 半乳糖(X α gal)的四缺培养平皿上生长的蓝色菌落 ,提取此酵母克隆的质粒 ,转化大肠杆菌后进行测序 ,并进行生物信息学分析。分析的结果显示 ,筛选出 19个阳性克隆 ,包括已知功能基因 17个 ,还有 1个克隆的测序结果与GenBank中的 1个未知功能序列有 4 4 %的同源性 ,初步证明了此基因与HCVNS3有结合活性。说明成功克隆了HCVNS3蛋白结合蛋白基因 ,为以后研究此基因在HCV致病机制以及在肝细胞中的生理功能提供了线索。

丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达及初步应用

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F基因的原核表达载体,并在大肠杆菌TG1中进行表达,用以检测丙肝患者体内抗体,并制备抗血清。方法提取患者血清中的HCVRNA,并进行基因分型。取鉴定为HCV1b型的病毒,用RT-PCR扩增HCVF蛋白基因的序列。将扩增产物插入pGEM-T载体中,测序正确后,用EcoRI、BamHI双酶切后,再插入表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌TG1,在IPTG诱导下表达GST-F蛋白。用亲和层析法纯化GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清。并用纯化的GST-F蛋白进行ELISA法检测丙肝患者血清抗F蛋白抗体。结果在细菌裂解液中检测到重组的融合蛋白,经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-F融合蛋白。应用Westernblot方法检测证实,用纯化的GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠得到了特异性的抗体。用纯化的GST-F蛋白进行ELISA检测120例丙肝患者血清抗F蛋白抗体,82例呈阳性。结论通过上述方法制备的融合蛋白纯度较高,免疫小鼠获得的抗体具有良好的特异性。用纯化的目的蛋白检测丙肝患者血清抗F蛋白的抗体的阳性率为68%,与国外的报道接近,说明在HCV感染的自然病程中有F蛋白的产生,为研究HCVF蛋白及与HCV相关疾病的诊断和治疗提供了条件。

猪丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6同源基因的克隆化研究

利用不同种属动物之间重要基因序列高度同源的理论 ,应用分子生物学与生物信息学技术和方法 ,克隆猪丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白结合蛋白 6(HCBP6)的同源基因。首先应用酵母双杂交技术 ,以表达HCV核心蛋白的表达载体作为诱饵 ,对于百万级的肝细胞cDNA文库酵母进行配合、筛选 ,首先获得人HCBP6的全长编码基因 ,然后应用美国国立生物工程中心 (NCBI)建立的核苷酸序列数据库 (GenBank)的同源基因的检索 ,搜索与之同源的来源于猪的表达序列标签 (EST)。然后根据基因同源性的原则 ,确定猪HCBP6的同源基因。获得了与HCV核心蛋白结合蛋白的 3 6个基因片段 ,其中之一命名为HCBP6。根据基因同源性搜索 ,获得了来源于猪的EST基因序列片段 ,最终确立了猪HCBP6的同源基因。利用不同物种之间基因同源性的原理、NCBI数据库GenBank同源基因的搜索 ,获得了猪HCBP6同源基因。

丙型肝炎病毒核心区蛋白在HepG2细胞中的表达

目的 :构建能稳定表达丙型肝炎病毒核心区蛋白的哺乳动物细胞系 ,以便对丙型肝炎病毒核心区蛋白的抗原性及其他功能作进一步研究。方法 :通过PCR扩增丙型肝炎病毒核心基因 ,将其亚克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中 ,用脂质体包裹后转染肝癌细胞系HepG2 ,通过G4 18筛选获得稳定转染细胞系 ,并通过间接免疫荧光法检测HepG2中丙型肝炎病毒核心区蛋白的表达。结果 :克隆的基因全长 5 94bp ,并经测序和重组质粒双酶切证实为所需目的基因 ;经间接免疫荧光验证实转染了目的基因的HepG2细胞中有丙型肝炎核心区蛋白的表达。结论 :丙型肝炎病毒核心区蛋白能在HepG2细胞中稳定表达。

牛丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6同源基因的克隆化研究

目的 利用不同种属动物之间重要基因序列高度同源的理论 ,应用生物信息学技术和方法 ,克隆牛丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白结合蛋白 6 (HCBP6 )的同源基因。方法 首先应用酵母双杂交技术 ,以表达HCV核心蛋白的表达载体为诱饵 ,对于百万级的肝细胞cDNA文库酵母进行配合、筛选 ,首先获得人HCBP6的全长编码基因 ,然后应用美国国立生物信息学中心 (NCBI)建立的核苷酸序列数据库 (GenBank)的同源基因的检索 ,搜索与之同源的来源于牛的表达序列标签 (EST)。然后根据基因同源性的原则 ,确定牛HCBP6的同源基因。结果 获得了与HCV核心蛋白结合蛋白的 36个基因片段 ,其中之一命名为HCBP6。根据基因同源性搜索 ,获得了来源于牛的EST基因序列片段 ,最终确立了牛HCBP6的同源基因。结论 利用不同物种之间基因同源性的原理 ,NCBI数据库GenBank同源基因的搜索 ,获得了牛HCBP6同源基因。生物信息学技术在后基因组时代具有重要地位和作用。