丙型肝炎病毒NS5A抑制剂的3D-QSAR研究

丙型病毒性肝炎感染是输血后肝炎的主要病因之一。NS5A蛋白的小分子抑制剂显示出很强的体外抑制病毒生长的活性,并且初步的临床评价也证实了NS5A抑制剂能很好地抑制体内丙型肝炎病毒的生长。因此,研发高效的NS5A小分子抑制剂为治疗丙型肝炎提供了新的策略。进行了daclatasvir丙型肝炎病毒NS5A复制抑制剂的三维定量构效关系(3D-QSAR)研究,通过SYBYL-X 2.1.1分子模拟软件系统搜寻方法搜寻出化合物的最低能量构象,然后在Triops力场中用共轭梯度最小化进行优化。应用比较分子力场分析(Co MFA)和比较分子相似性指数分析(Co MSIA)进行分子活性构象的选择、分子叠合、建立空间场范围以及数据统计。用22个衍生物作为训练集建立模型,用6个衍生物作为测试集来验证模型的优劣。结果表明:Co MFA模的交叉相互验证系数q2=0.578,回归系数r2=0.939,Co MSIA模型的q2=0.584,r2=0.968。这些结论为丙型肝炎病毒NS5A复合体抑制剂的药物设计和筛选提供了理论依据。

丙型肝炎病毒NS5B RNA聚合酶抑制剂研究进展

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是引起慢性肝炎并进而发展为肝硬化和肝细胞癌的主要病原体之一。目前,临床上采用α-干扰素（IFN-α）和利巴韦林（RBV）联合用药治疗丙型肝炎,但有效率仅为40%~50%。寻找HCV特定靶向抗病毒治疗药物是抗HCV研究的重要方向,相应靶点包括NS2和NS3蛋白酶,NS4A、NS4B、NS5A和NS5B,其中以NS5B RNA依赖性RNA聚合酶（NS5B RdRp）为靶标的抗HCV药物研究近年来颇受关注。本文在介绍NS5B及NS5B RdRp结构和功能的基础上,总结归纳以NS5B RdRp为靶点的HCV特定靶向抗病毒治疗药物研究的主要策略,以及近年来相关NS5BRdRp抑制剂的研究进展。

基于机器学习方法的丙型肝炎病毒聚合酶NS5B非核苷抑制剂的定量构效关系研究

对89个苯并异噻唑和苯并噻嗪类丙型肝炎病毒(HCV)NS5B聚合酶非核苷抑制剂进行了定量构效关系(QSAR)研究.采用遗传算法组合偏最小二乘(GA-PLS)和线性逐步回归分析(LSRA)两种特征选择方法选择最优描述符子集,然后建立多元线性回归和偏最小二乘线性回归模型.并首次尝试使用遗传算法耦合支持向量机方法(GA-SVM)对两种特征选择方法所选的描述符子集分别建立非线性支持向量机回归模型.三种机器学习方法所建模型均得到比较满意的预测效果.采用LSRA所选的6个描述符建立的三个QSAR模型对于测试集的相关系数为0.958-0.962,GA-SVM法给出最好的预测精度(0.962).采用GA-PLS所选的7个描述符建立的三个QSAR模型对于测试集的相关系数为0.918-0.960,偏最小二乘回归模型的结果最好(0.960).本工作提供了一种有效的方法来预测丙型肝炎病毒抑制剂的生物活性,该方法也可以扩展到其他类似的定量构效关系研究领域.

丙型肝炎病毒NS5A抑制剂--达卡他韦

达卡他韦(Daklinza)是由美国百时美-施贵宝公司(BMS)研制的口服丙型肝炎病毒(HCV)NS5A抑制剂。继2014年欧盟批准其与联合其他抗病毒药用于基因型1-4慢性丙型肝炎成人患者的治疗后,2015年7月美国FDA批准其与索非布韦[sofosbuvir]联合用于慢性HCV基因型3感染的治疗。达卡他韦是第一个无需同时给予干扰素或利巴韦林即可有效治疗基因型3 HCV感染的药物,为该类患者提供了一个新选择,包括那些不能耐受利巴韦林患者。笔者就达卡他韦的基本信息、作用机制、药代动力学、药物相互作用、临床试验及应用等研发动态作一概述,以期能为医院临床用药及药物研究开发提供参考。

抑制丙型肝炎病毒NS5A基因表达的shRNA系统的构建及意义

目的:构建抑制丙型肝炎病毒NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用。方法:根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后线性的pSilencerTM3.1-H1neo载体的H1启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒,进行电泳,将3个不同的RNAi质粒和阴性对照质粒分别与HCV NS5A真核表达质粒共转染正常肝细胞HL-7702细胞系,用Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白表达。结果:对重新构建的pSilencerTM3.1-H1neoHCV NS5A-R1、R2、R3质粒进行测序,与设计的序列完全相同;3个质粒电泳均在4 348 bp处出现特异性条带;Western blotting印迹法测得R1、R2和R3的NS5A蛋白未见明显条带,阴性对照质粒NS5A蛋白在相对分子质量5 600处出现条带。结论:设计合成的3个不同位点的63个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全正确,对HCV NS5A基因表达有特异性抑制作用。

广西地区基因1型丙型肝炎患者NS5A抑制剂天然耐药突变的研究

目的:探讨广西地区未进行抗病毒治疗的基因1型丙型肝炎患者对NS5A抑制剂的天然耐药突变情况。方法:收集2013年5月至2017年11月在广西医科大学第一附属医院感染性疾病科门诊就诊的基因1型丙型肝炎患者134例。提取患者的HCV RNA,设计针对NS5A区域的特异性引物进行巢式PCR扩增,PCR产物经纯化后测序,进行序列比对和耐药分析。结果:134例样本中有119例(基因1a型19例,基因1b型100例)扩增成功,其中53例(44.5%)存在天然耐药位点突变。基因1a型NS5A区7例(36.9%)存在耐药突变(Q30H,n=1,5.3%;H58P,n=1,5.3%;M28T+H58P,n=1,5.3%;H58P+E62D,n=4,21.0%)。基因1b型有46例(46.0%)存在天然耐药突变(R30Q,n=23,23.0%;Y93H,n=6,6.0%;Q54H,n=4,4.0%;P58S,n=4,4.0%;Q54H+P58S,n=4,4.0%;L31M+R30Q,n=2,2.0%;Q54H+R30Q,n=2,2.0%)。结论:广西地区未接受抗病毒治疗的基因1型丙型肝炎患者中有部分患者存在针对NS5A抑制剂的天然耐药位点突变,其突变有单位点突变也有联合位点突变。

基于丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B晶体结构的抑制剂筛选

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是引起慢性肝炎的主要病原体之一,主要通过血源传播,严重危害人类的健康,寻找有效的抗病毒药物具有重要意义。随着HCV复制过程中一些重要蛋白以及这些蛋白与相关配体或抑制剂的精确三维结构的解析,对这些蛋白的三维结构进行设计和筛选,成为目前开发治疗HCV感染药物的重要手段。NS5B RNA聚合酶是HCV复制过程中的关键酶,是研究抗HCV病毒药物的一个重要靶点。本文以NS5B的晶体结构为基础,用晶体浸泡的方法进行NS5B蛋白的抑制剂筛选,得到了小分子抑制剂与NS5B蛋白的精确三维结构,从原子水平上阐释了抑制剂对HCV NS5B蛋白的抑制机理。

慢性丙型肝炎患者NS5B聚合酶抑制剂耐药位点检测及特点分析

目的针对186例未行抗病毒治疗的慢性丙型肝炎(慢性丙肝)患者进行NS5B聚合酶抑制剂相关的耐药位点检测,同时分析其特点。方法依据NS5B区域的变异位点相关特点,将其分成3段来进行扩增,同时NS5B聚合酶抑制剂相关的耐药位点分析主要采用自行设计的型别特异性引物来进行巣式PCR,产物纯化后直接进行测序鉴定,同时还对患者的临床资料来进行相关分析。定量资料,比如人口学指标、生化指标以及血液学指标、病毒学指标等参数之间的比较主要采用t检验或ANOVA方差进行分析,而组间的非参数比较主要采取Mann Whitney U检验,而分类资料采用χ~2检验。结果核苷类聚合酶抑制剂耐药的变异位点A15G、S96T、S282T主要是在HCV 6a型别中发生,在HCV 1b型别中却并未发现变异位点;对非核苷类的聚合酶抑制剂耐药的变异位点如C316N、S365A主要是在HCV 1b型别中可见,1482L、V499A主要是在HCV 6a以及HCV 2a型别中多见。另外一些新的变异位点A15S、S365P、S365F、S368A以及S368L等位点的变异能否导致耐药性还需进一步研究。结论我国的慢性丙肝患者对于NS5B聚合酶抑制剂确实存在预存的耐药位点,同时变异发生率主要依据HCV基因型而不同,并且不同的基因型号也会存在不同的耐药,这就提示可以在抗病毒药物治疗前进行基因检测。

第二代丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展

本文综述了近年来基于特拉匹韦(telaprevir)、波西匹韦(boceprevir)和BILN-2061等第一代HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的第二代抑制剂的结构改造。第二代抑制剂可有效提高抑制效力,显著改善药代动力学参数,可在一定程度上克服由第一代抑制剂诱导产生的耐药性。同时探讨了各类抑制剂的构效关系。

丙型肝炎病毒NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展

综述了近年来丙型肝炎病毒NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究概况,从结构上分为肽醛类、硼酸类、α-酮酸类、肽酸类、四氢吡咯-5,5-反式-内酰胺非肽类和α-酮酰胺等。并探讨了各类药物的构效关系。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到 12 1个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 115个 2 0 0～10 0 0bp的插入片段 ,对其中的 90个片段测序 ,并进行同源性分析 ,显示 31种已知基因编码蛋白和 15种未知功能基因序列 ,包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示 ,成功构建了HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,该文库的建立为进一步阐明HCVNS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。

筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因

细胞内蛋白 蛋白的结合是丙型肝炎病毒 (HCV)与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白 5A(NS5A)被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子 ,参与HCV的复制、转录和信号传导等过程 ,但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系 ,作者采用酵母双杂交系统 3,在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选 ,得到 35个与NS5A特异性结合的阳性克隆 ,包括载脂蛋白、线粒体单体型基因、磷脂酸酸性磷酸酶等 11种已知功能蛋白质基因和 3个未知功能基因。

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因。方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1000 b插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因。结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因 ,研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术 (SSH)及生物信息学技术 ,以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(-) -NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利用表达序列标签 (EST)序列数据库的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP9,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 93 70。结果 NS5ATP9基因的编码序列全长为 3 3 6个核苷酸 (nt) ,编码产物由 111个氨基酸残基 (aa)组成 ,并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因2基因组DNA结构分析及其不同剪切体的克隆化研究

目的:HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2及其不同剪接体基因序列的确立、克隆化研究. 方法:依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得,提取HepG2 细胞的总RNA,进行反转录(RT-PCR),扩增产物与原核表达载体连接,进行测序鉴定. 结果:经测序鉴定成功获得新基因的编码序列,并意外发现了NS5ATP2的不同剪接体,对NS5ATP2基因组进行分析,获得剪接体的编码序列,并成功进行了克降化研究. 结论:利用分子生物信息学技术,发现并鉴定了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2(615)及其可变剪接体NS5ATP2(216),为研究新基因的生物学功能及丙肝发病机制提供新的依据.

慢性丙型肝炎患者NS3/4A蛋白酶抑制剂预存耐药的临床研究

【目的】了解我国华南地区从未接受任何抗病毒治疗的慢性丙型肝炎(慢丙肝)患者NS3/4A蛋白酶抑制剂相关耐药位点的流行情况、临床特点包括其对干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗的影响。【方法】在接受抗病毒治疗前对183例慢丙肝患者的NS3/4A蛋白酶抑制剂相关的耐药位点采用自行设计型别特异性引物行巢式PCR,PCR产物纯化后直接测序法鉴定,有变异的患者为变异组(125例),无变异的患者为野生组(37例),对两组患者的临床资料包括干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗后的持续病毒应答率等进行分析。【结果】183例患者中162例患者样本的NS3区扩增成功,其中125例(77.16%)患者检出耐药相关的变异位点266个,其中HCV 1b型A156S变异率为18.33%(11/60),T54S为5.00%(3/60);HCV 2a型V36L变异率为100.00%(14/14),A156S为64.29%(9/14);HCV 6a型Q80K变异率为95.45%(84/88),V36L为4.55%(4/88),D168E为2.27%(2/88),变异组患者经干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗后的持续病毒性应答率为81.60%(102/125),而野生组的为81.03%(30/37),两者比较无明显差异(P=0.943)。【结论】我国不同基因型的慢丙肝患者对NS3/4A蛋白酶抑制剂存在不同的预存耐药,耐药变异对慢丙肝患者疾病状态包括干扰素联合利巴韦林的疗效无影响。预存耐药的存在警示我们未来在使用此类药物时需分析病毒基因型及预存耐药变异情况,从而为患者提供最好的病毒学监测及最优的治疗方案。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的 :探讨丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法 :扩增HCVNS5A基因 ,构建HCVNS5A基因真核表达载体 pcDNA3 1( ) NS5A ;并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法检测转染细胞中HCVNS5A蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒 pCAT3- promoter共转染HepG2细胞 ,用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果 :质粒pcDNA3 1( ) NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCVNS5A蛋白 ,共转染实验中 pcDNA3 1( ) NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的 3 8倍。结论 :构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白 ,并能够反式激活SV4 0病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCVNS5A蛋白反式激活的靶基因 。

基于丙型肝炎病毒NS5B基因序列分析的基因分型

目的 :建立基于丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法 ,对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法 :用HCVRNA实时荧光定量检测试剂盒对慢性丙型肝炎患者血清标本的HCVRNA水平进行定量分析。用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和套式 PCR扩增HCVRNA阳性的 4 1份标本的部分HCVNS5B区基因 ,PCR产物经回收、纯化后直接进行测序分析。从GenBank中下载 2 5份不同基因型的HCV原型序列 ,用NS5B区 2 2 2bp的基因片段构建系统进化树 ,对临床标本相应的HCVNS5B区序列进行分析。结果 :基于HCVNS5B基因序列的系统进化树分析 ,可成功地对本组 4 1份标本进行基因分型。分型结果显示 ,1b型占 85 .4 % (35 / 4 1) ,2a型占 12 .2 0 % (5 / 4 1) ,3a型占 2 .4 4 % (1/ 4 1)。结论 :基于HCVNS5B区基因序列的系统进化树分析是一种可靠和方便的HCV基因分型方法。上海地区的HCV基因型以

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因1的克隆

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制. 方法:以HCV NS5A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,分析并克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因. 结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染pcDNA3.1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP1. NS5ATP1基因的编码序列全长为1011个核苷酸(nt),编码产物由336个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HCV NS5ATP1是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白,而SSH是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.通过这种技术,发现了HCV NS5ATP1反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为进一步研究HCV NS5ATP1蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

丙型肝炎病毒NS5B在Hep3B细胞的表达及活性分析

目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检测NS5B的细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结果RT-PCR和Westernblot发现转染NS5B基因的Hep3B细胞产生NS5B mRNA和NS5B蛋白,荧光素酶分析表明Hep3B细胞表达的NS5B蛋白具有细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结论人肝癌细胞系Hep3B细胞可以成功表达NS5B基因,且表达的NS5B蛋白具备细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。