丙型病毒性肝炎抗体检测与HCV高敏核酸检测对病毒性丙型肝炎的筛查价值研究

目的通过对本院2019年1月至2022年9月需进行手术、输血或其他侵入性医疗服务的住院患者的HCV血清学抗体及高敏HCV RNA筛查结果进行回顾性分析,探讨丙型病毒性肝炎抗体检测与HCV高敏核酸检测对病毒性丙型肝炎的筛查检测价值。方法对本院相关住院患者进行Elecsys Anti-HCV II或(和)高敏HCV RNA检测,统计分析其检测结果。结果HCV血清学抗体检测22443人次,阳性率为0.68%,阳性COI中位数为38.4(1.0~165)。高敏HCV RNA检测34628人次,阳性率0.30%,阳性病毒载量中位数为1.00×10^(6)IU/mL(3.50×10^(1)~4.00×10^(7)IU/mL)。两种方法学均显示45~59岁人群阳性率显著高于其他人群(P<0.001)。两种检测有重合的样本共17785人次,HCV抗体血清学阳性率为0.70%。高敏HCV RNA阳性率0.22%,如以高敏HCV RNA为丙型肝炎现症感染的标准,HCV抗体血清学检测HCV现症感染的灵敏度为100.00%(95%CI 89.09%~100.00%),特异性为99.52%(95%CI 99.41%~99.61%),现症感染阳性预测期PPV为32.00%(95%CI 23.82%~40.18%),阴性预期值为100.00%。HCV抗体血清学检测COI值与高敏HCV RNA检测的病毒载量无线性相关性,COI<10和COI>100的HCV RNA阳性率低。结论HCV抗体检测和高敏HCV RNA均为有效的丙型肝炎筛查手段,需进一步加强对重点人群的丙型肝炎感染管理。

丙型肝炎病毒感染的不同人群HCVRNA定量研究

目的了解丙型肝炎病毒感染的不同人群血清 HCV RNA 水平,比较定性和定量 PCR 结果,探讨 HCV RNA 含量与血清ALT 的相关性.方法采用荧光定量 PCR 和逆转录巢式定性 PCR 同时检测136例丙型肝炎病毒感染者血清 HCV RNA,并测定定量 PCR(+)者血清 ALT.用相关系数分析 HCV RNA 含量与血清ALT 的关系.结果定性 PCR 阳性率为80.88%,定量 PCR 阳性率为77.94%.两者相对符合率为94.12%.定量 PCR(+)血清(106例)HCV RNA 含量在10^(7.04)～10^(10.96) 拷贝·L^(-1).无症状献血员 HCV RNA 含量显著低于慢性丙型肝炎、肝硬变和肝细胞癌患者(P<0.05),肝细胞癌患者血清 ALT 水平显著低于慢性丙型肝炎(P<0.05).HCV RNA 滴度与血清 ALT 呈正相关(r=0.61,P<0.01).结论定性和定量检测结果有很好的一致性.病毒复制水平上升在肝损伤和肝病进展中可能起重要作用.

HCV基因型和HCVRNA检测在丙型肝炎病毒母婴传播中的意义

从流行病学角度来探讨丙肝病毒母婴垂直传播的可能性 ,并探讨此传播途径在丙肝流行中的作用。利用 RT- nested PCR方法检测感染率和基因分型 ,采用双脱氧链终止法测定 HCV- PCR产物序列。抗 - HCV阳性 45例母血中 HCV- RNA阳性 38例 (84.44% )。抗 - HCV阳性 30例脐血中 HCV- RNA阳性 1 4例 (46.67% ) ,这 1 4例抗 - HCV阳性的母婴 HCV- RNA均阳性 ,1 4对母婴的基因分型完全一致。以上结果可以表明母婴垂直传播是

乙型肝炎病毒DNA、丙型肝炎病毒RNA在原发性肝癌患者中的表达及临床意义

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)DNA、丙型肝炎病毒(HCV)RNA在原发性肝癌患者中的表达及临床意义。方法 选取145例原发性肝癌患者和106例肝硬化患者,分别作为原发性肝癌组和肝硬化组。比较两组患者的HBV、HCV感染率,分析原发性肝癌患者HBV感染模式及HBV DNA阳性分布情况。采用Logistic回归模型分析原发性肝癌的影响因素。随访2年,采用Cox回归模型分析原发性肝癌患者预后的影响因素。结果原发性肝癌组患者HBV、HCV感染率均高于肝硬化组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。原发性肝癌患者中,乙型肝炎e抗体(抗HBe)(+)乙型肝炎核心抗体(抗HBc)(+)HBV表面抗原(HBsAg)(+)感染模式占比最高(50.50%),且HBV DNA阳性患者主要分布于该模式中,其次为抗HBc(+)HBsAg(+)(16.83%)。原发性肝癌组患者HBsAg(+)、抗HBe(+)、HBV DNA(+)、HCV RNA(+)比例均高于肝硬化组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,HBV DNA阳性、HCV RNA阳性均是原发性肝癌的独立危险因素(P﹤0.05)。原发性肝癌患者的2年生存率为70.34%,2年无进展生存率为53.10%。无嗜酒史、肿瘤最大径≤5 cm、HBV DNA阴性、HCV RNA阴性原发性肝癌患者的2年生存率分别高于有嗜酒史、肿瘤最大径﹥5 cm、HBV DNA阳性、HCV RNA阳性患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,HBV DNA阳性和HCV RNA阳性均是原发性肝癌患者预后的独立危险因素(P﹤0.01)。结论 原发性肝癌患者HBV、HCV感染率均较高,HBV DNA阳性、HCV RNA阳性均是原发性肝癌患者预后的独立危险因素。

丙型肝炎病毒分片段抗体与HCVRNA的检测分析

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)分片段抗体(HCV-C,HCV-NS3,HCV-NS4,HCV-NS5)对丙肝的诊断价值。方法对ELISA法抗-HCV总抗体阳性的55份阳性血清及80份可疑血清再进行分片段抗体ELISA检测及RT-PCR。结果55份ELISA法抗-HCV总抗体阳性血清经分片段抗体ELISA检测后,抗-NS3、抗-C的检出率最高,分别为96.4%、89.1%;两个以上片段检测结果阳性的血清有54份,与RT-PCR结果(HCVRNA阳性52份)高度符合。80份可疑血清中10份抗-C和抗-NS3同时阳性和9份HCVRNA阳性。结论HCV分片段抗体ELISA法有很高的敏感性和特异性,与RT-PCR法基本一致。抗-NS3、抗-C在HCV的诊断中有重要的意义,抗-NS5和抗-NS4有诊断的互补作用。

丙型肝炎患者血清miR-155、miR-205-5p水平变化及诊断价值

目的探讨丙型肝炎患者血清miR-155和miR-205-5p表达水平的变化及临床意义。方法收集丙型肝炎患者141例,根据基因分型将其分为丙型肝炎病毒(HCV)-1b组(92例)和非HCV-1b组(49例),另取同期于本院进行体检的健康志愿者141例为对照组。比较3组一般资料、生化指标及血清miR-155、miR-205-5p水平;根据肝炎活动度分级,将丙型肝炎患者分为G0、G1、G2、G3、G4级,比较5组血清miR-155、miR-205-5p水平;受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-155、miR-205-5p诊断丙型肝炎患者肝炎活动度为G1—G4级的临床价值。结果HCV-1b组和非HCV-1b组丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)水平均高于对照组,血清白蛋白(ALB)水平低于对照组(P<0.05);对照组、非HCV-1b组和HCV-1b组血清miR-155水平依次升高,血清miR-205-5p水平依次降低(P<0.05);随着肝炎活动度分级的增加,血清miR-155水平依次升高,miR-205-5p水平依次下降(P<0.05);miR-155、miR-205-5p以及两者联合诊断丙型肝炎患者肝炎活动度为G1—G4级的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.855、0.793和0.913,联合优于二者各自单独诊断(P<0.05)。结论丙型肝炎患者血清miR-155水平上升,miR-205-5p水平下降,两者联合对肝炎活动度为G1—G4级的诊断具有较高效能。

脂质体转染法与电转染法在丙型肝炎病毒RNA转染人肝癌细胞中的应用效果比较

目的：比较脂质体转染法与电转染法在丙型肝炎病毒（ HCV ） RNA转染人肝癌细胞中的应用效果。方法培养人肝癌细胞Huh7．5-CD81并分为A、B组及对照组。 A组采用电转染质粒pHebei（E1E2）／JFH1来源的HCV RNA；B组采用脂质体转染质粒pHebei（E1E2）／JFH1来源的HCV RNA；对照组采用脂质体转染复制缺陷质粒pJFH1／GND转录获得的HCV RNA。光学显微镜下观察各组转染后细胞形态，采用免疫荧光法（ IFA）检测三组转染效率，real-time PCR法检测三组细胞培养液上清中的HCV RNA，采用TCID50法检测A、B组细胞培养液上清中的丙型肝炎病毒（HCVcc）感染滴度。结果 A组转染使用细胞数为1×106，转染后第2天细胞损伤过半，边缘毛糙；B组转染使用细胞数为2×105，转染后第2天细胞基本无损伤。 A组转染效率为9．98％±0．83％，B组转染效率为2．58％±0．39％，两组转染效率相比，P＜0．01；对照组未检出荧光阳性细胞。 A、B组转染后细胞培养液上清中HCV RNA拷贝数均呈现先下降后升高的趋势，最终稳定于106 copies／mL。 A组转染后21 d、B组转染后31 d方能检测到HCV感染滴度，A、B组收获HCV最高感染滴度均为104 ffu／mL。结论脂质体转染和电转染两种方法均可建立嵌合HCV的人肝癌细胞培养体系，脂质体转染法对细胞的损伤较小，电转染法转染效率较高、收获HCVcc的时间较短，但两种方法收获的HCVcc感染滴度无明显差异。

互补引物/模板评价毕加酵母表达的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶

构建含有感染性克隆HCV非结构基因 5b区序列的酵母表达质粒 ,转化毕加酵母 ,获得持续、可溶性HCVRNA依赖的RNA聚合酶 (RdRp)的表达 ,纯化蛋白在SDS -PAGE及Westernblot中显示出特异性的 6 4 2kDHCVRdRp蛋白带 ,同聚引物 /模板测定显示RdRp的活性极低 ,延长反应时间 ,RNA聚合活性仅轻度升高。采用合成的杂聚互补引物 /模板 ,未发现核苷酸在毕加酵母表达的RdRp作用下掺入模板 ,随时间延长 ,杂聚互补引物 /模板降解。

外周血单核细胞中丙型肝炎病毒RNA正负链检测的临床意义

目的通过对外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）中ＨＣＶＲＮＡ正负链的检测，来探讨其与丙型肝炎慢性化及干扰素治疗的关系．方法慢性丙型肝炎患者４０例，其中干扰素治疗者１０例，分离血清及ＰＢＭＣ．异硫氰酸胍－酚－氯仿抽提法提取ＨＣＶＲＮＡ，应用逆转录－巢式ＰＣＲ技术检测ＨＣＶＲＮＡ正负链．结果血清正链ＨＣＶＲＮＡ阳性率为６７５％，但负链均为阴性，ＰＢＭＣ中正链ＨＣＶＲＮＡ阳性率为５７５％，负链的阳性率为３５０％．其中３例患者血清中正链ＨＣＶＲＮＡ为阴性，而ＰＢＭＣ中为阳性．１０例干扰素治疗者在治疗结束时血清正链ＨＣＶＲＮＡ６０％转阴，ＰＢＭＣ中负链ＨＣＶＲＮＡ８０％转阴，而正链仅３７５％转阴．结论ＨＣＶ能在ＰＢＭＣ中存在和复制，这可能是导致丙型肝炎易发生慢性化的原因之一．

逆转录──多聚酶链反应检测丙型肝炎病毒RNA方法的建立及实验条件分析

对逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测丙型肝炎病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＲＮＡ）的方法学进行了探讨。逆转录与多聚酶链反应是否在同一反应管内进行，对ＨＣＶＲＮＡ检测结果没有明显影响，但在操作难易程度、ＴａｑＤＮＡ聚合酶的选择等方面有差别。在防止污染的前提下，套式ＰＣＲ可提高ＨＣＶＲＮＡ检出率（７．８３％），这对于极低水平ＨＣＶ感染的诊断十分重要。本文对受检标本的贮存方式也进行了初步探讨。

siRNA抑制丙型肝炎病毒IRES介导的基因表达

以HCVIRES为靶位 ,应用T7RNA多聚酶体外转录合成了 5条小干扰RNA(siRNA) .脂质体转染法将其导入HCVIRES介导萤光素酶表达的转基因细胞 (HepG2 .970 6 )中 ,通过测定萤光素酶的量 ,评价T7siRNA对HCV介导基因表达的抑制作用 .结果表明 ,所合成的 5条T7siRNAs ,均能特异性地抑制萤光素酶基因的表达 ,抑制率分别为 94 31%、80 0 1%、78 0 1%、80 33%、85 6 4% ,其中以靶向HCVIRES第二茎环结构的T7siRNA1抑制率最高 ,且对HCV基因的抑制作用有剂量依赖性 ,随T7siRNA1量的增加 ,抑制率逐渐增强 .siRNA抑制HCV基因的作用具有良好的特异性 ,改变其中 1个核苷酸即无显著抑制作用 .

丙型肝炎患者血清HCVRNA含量与抗HCV和ALT的相关性

目的探讨丙型肝炎病毒患者血清丙型肝炎病毒核酸(HCVRNA)、丙型肝炎病毒抗体(抗HCV)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的相关性。方法取123例确诊丙型肝炎的患者的血清,采用荧光定量PCR技术检测其HCVRNA含量,用ELISA法检测抗HCV和酶动力学法检测ALT浓度水平,并对所得数据进行统计学分析。结果根据HCVRNA含量(拷贝/L)将资料分为<105组、105-6组、107-8组和>109组,各组的抗HCV阳性率分别为72.4%、84.6%、100%和100%;ALT均值(IU)分别为38.8、88.2、112.1和128.3;ALT异常率分别为24.1%、65.4%、88.9%和100%。HCVRNA含量对数值与ALT线性相关关系分析和显著性检验呈正相关(r=0.441,P<0.05)。结论抗HCV阳性率、ALT的异常率及平均值与HCVRNA的含量有关,HCVRNA含量越高,抗HCV阳性率和ALT含量的均值与异常率越高;HCVRNA含量与ALT含量水平呈正相关。

丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针，建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法，同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较，发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ，但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断，可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性，以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制，打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化，对治疗的评价，以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。

TRIzol法与磁珠法用于丙型肝炎病毒RNA定量检测的比较

目的比较TRIzol法与磁珠法对丙型肝炎病毒(HCV)RNA定量检测结果的影响。方法收集117例丙型肝炎病毒感染阳性患者的血清及其基因分型信息。分别采用TRIzol法与磁珠法提取患者血清样本的HCV RNA,qPCR检测提取HCV RNA的病毒载量,分析两种提取方法所得HCV RNA检测结果的差异。结果 qPCR结果显示TRIzol法和磁珠法具有良好的线性相关性:y=0.978x+0.063(R2=0.973)。Bland-Altman统计分析显示TRIzol法提取的HCV RNA病毒载量对数值的平均值略低于磁珠法,但差异无统计学意义(P>0.05)。基因型分析结果显示1a、1b、2a、3a和6a基因型中两种提取方法差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 TRIzol法提取HCV RNA的定量检测结果和磁珠法相当,且成本低廉,可在国内广泛用于试剂盒的开发和HCV RNA临床检测。

Eu标记RT-PCR检测丙型肝炎病毒RNA

目的 采用一种新的铕螯合物BHHCT ,制备高灵敏度荧光标记物 ,建立检测丙型肝炎病毒 (HCV)RNA的方法。方法 采用柱层析纯化的方法抽提血清中HCVRNA。以 5′端带有生物素的引物进行RT PCRTth酶一步法扩增 ,通过固定于微孔板上的捕获探针与带有生物素的PCR扩增产物杂交后 ,利用标记有铕的链霉亲合素与生物素的特异性结合 ,将铕连接到待测核酸上 ,在特定波长的激发光激发下发出荧光 ,进行检测。结果 铕标记检测法与酶标法的变异系数、敏感性、特异性分别为10 .43%、10 0 %,10 0 %与 16 .2 5 %,94%,10 0 %。结论 Eu标记RT PCRTth酶一步法检测HCVRNA ,具有敏感、特异、快速、重复性好、不受环境因素影响和无溴乙锭污染等优点 ,可望取代酶标法及电泳法。

142例慢性丙型肝炎患者血清HCV-cag和HCVRNA检测结果分析

目的探讨丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cag)检测与慢性丙型肝炎患者血清HCV RNA的相关性。方法采用ELISA法检测血清HCV-cag,采用FQ-PCR法检测HCV RNA。结果在142例CHC患者血清中,HCV-cag和HCV RNA阳性率分别为45.1%和43.0%(P>0.05);两种标志物均为阳性者58例(95.1%),均为阴性者75例(92.6%);81例HCV RNA阴性血清HCV-cag阳性6例(7.4%),而HCV RNA阳性血清HCV-cag阳性率大于85%,不同HCV RNA载量间阳性率无显著性差异。结论 HCV-cag与HCV RNA检测结果有一定的相关性。在CHC诊疗中,HCV-cag检测可作为判断HCV感染和病毒复制的指标,但不能替代HCV RNA检测。

丙型肝炎病毒核心蛋白抑制shRNA介导的RNA干扰作用

目的研究丙型肝炎病毒编码的蛋白对RNA干扰的抑制作用,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子。方法构建丙型肝炎病毒不同蛋白质的真核表达质粒,加入萤火虫荧光素酶基因的RNA干扰体系,共转染HeLa细胞,检测萤火虫荧光素酶活性以观察RNA干扰效果的变化,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子。在针对内源性GFP的RNA干扰体系中进一步确证该种抑制作用。利用共转染方法观察该蛋白抑制RNA干扰的剂量效应关系、在不同细胞系中的作用以及对siRNA介导的RNA干扰是否有相同的拮抗作用。结果加入核心蛋白后,萤火虫荧光素酶活性恢复到80%,与空白对照比较有显著性差异(P<0.05)。在绿色荧光蛋白RNA干扰体系中,核心蛋白使绿色荧光蛋白的表达强度明显增加。该种对抗RNA干扰的作用在HepG2、HEK293和HeLa细胞中均存在,且呈剂量依赖关系。在siRNA介导的RNA干扰体系中,加入核心蛋白后萤火虫荧光素酶活性无显著性变化(P>0.05)。结论核心蛋白能够对抗shRNA介导的RNA干扰作用,但不能对抗siRNA介导的RNA干扰作用,这种作用具有普遍性。核心蛋白对抗RNA干扰的作用可能有利于提高丙型肝炎病毒在宿主细胞内的生存能力并导致持续感染,亦可能在丙型肝炎病毒致病机制中发挥重要作用。

丙型肝炎患者血液、体液中HCVRNA检测及其传染性研究

通过对１６例（男７例，女９例）血清丙型肝炎病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＲＮＡ）阳性的输血后丙型肝炎患者唾液、精液、阴道分泌物的ＨＣＶＲＮＡ检测及其配偶和子女的ＨＣＶ感染状况的调查，对丙型肝炎的血液外传播途径进行了研究。丙型肝炎患者唾液、精液、阴道分泌物中ＨＣＶＲＮＡ均有较高的检出率，其中以精液最高，达５７．１４％（４／７），唾液次之，为３１．２５％（５／１６），阴道分泌物最低，为２２．２２％（２／９）。家庭成员中，２例（１２．５０％）配偶感染ＨＣＶ，１６个家庭的子女无１例感染ＨＣＶ。２例引起家庭内传播者均为慢性丙型肝炎患者。结果显示：家庭内密切接触（包括性接触）存在传播ＨＣＶ感染的潜在危险性。

双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的克隆表达及其对丙型肝炎病毒蛋白合成的抑制作用

α干扰素为治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的主要药物,但部分患者呈干扰素耐受而不能获得持久的病毒阴转,其可能的原因之一是病毒通过其编码的蛋白(NS5A及E2)抑制干扰素诱导的抗病毒效应分子———双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的活性.而关于PKR是否在IFN-α抗HCV的机理中起抑制作用目前仍有争议.为研究PKR对HCV蛋白合成环节是否有抑制作用,通过构建野生型PKR真核表达载体(pPKRwt)及主要起负性调节作用的缺失突变PKR真核表达载体(pPKRΔ6),并将pPKRwt/pPKRΔ6与HCV复制子RNA同时转染Huh7细胞进行共表达,用Western印迹检测HCV IRES下游的NPTⅡ蛋白表达水平,与转染空载体的对照细胞及单用IFN-α处理的细胞相比较.结果显示:表达PKRwt的细胞中NPTⅡ蛋白水平低于转染空载体的对照细胞,但高于经IFN-α单独处理的细胞;表达PKRΔ6的细胞中NPTⅡ蛋白水平与对照细胞无明显差别,但PKRΔ能部分抵消IFN-α的抑制作用,说明在IFN-α抑制HCV IRES指导的蛋白合成中,PKR有一定的抑制作用,但可能还有其它的PKR非依赖机制参与.