高丁醇耐受性丙酮丁醇生产菌株选育研究进展

以化石燃料为主的传统不可再生能源在促进经济发展过程中起到重要作用,但同时也对生态环境造成了严重的危害,因此,新型可再生能源的研究与应用已成为全球能源领域重要方向。生物丁醇因具有环境友好、可再生等优点而成为生物质能源领域研究的热点。然而由于丁醇的毒害作用导致丙酮丁醇发酵过程中出现低产物浓度、低产率及低转化率现象,因此提高发酵菌株的丁醇耐受性是增强丙酮丁醇发酵经济性的重要途径之一。该文综述了不同诱变育种、适应性驯化策略、合成生物学手段等不同方法提高丁醇生产菌株的丁醇耐受性的原理及国内外研究进展,讨论了各方法在实践中的优缺点与挑战等问题,以期为提高微生物细胞的丁醇耐受性菌株的选育提供一些理论与实践参考。

丙酮丁醇梭菌ART18发酵葛渣水解液生产丁醇的研究

为降低传统丙酮丁醇发酵成本,以葛渣为原料进行丙酮丁醇发酵。通过研究葛渣经酸水解后残渣的有无、发酵温度、p H值调节剂的种类和含量以及活性炭的添加量等对发酵的影响,以期提高丁醇的生产强度。试验结果表明,通过对上述试验条件进行优化,丁醇及总溶剂产量均有较大提高,且最优的发酵温度、p H值调节剂含量及活性炭添加量分别为37℃、4. 0 g/L和3%,在最优条件下丁醇、总溶剂产量分别为7. 50、12. 98 g/L。当将上述试验结果在5 L发酵罐进行放大培养时,丁醇产量、丁醇生产强度、总溶剂的生产强度分别达到7. 30、0. 08、0. 13 g/(L·h)。

基于果糖与葡萄糖不同混合比例的丙酮丁醇发酵

介绍了以不同底物的丁醇发酵结果,阐述了在以55g/L葡萄糖与果糖(1∶4)混合糖模拟菊芋物料为底物的丁醇发酵过程中存在果糖利用及丁醇产量较低等问题,研究了基于葡萄糖与果糖不同混合比例(1∶2、2∶3、3∶2及3∶1)的丁醇发酵性能。研究结果说明了随着混合比例提高,发酵时间由76h缩短至48h,菌体最大生物量OD620由2.1提高至4.3,而当葡萄糖与果糖混合比例为1∶2时,发酵过程中菌体细胞对果糖代谢能力最佳,且终点残糖浓度仅为2.1g/L,果糖利用效率达到95.03%,丁醇及总溶剂产量分别达到9.7g/L与16.0g/L。

以新鲜马铃薯为原料发酵丙酮丁醇的研究

文章研究了以新鲜马铃薯为底物,利用丙酮丁醇梭菌GX01发酵生产丙酮丁醇。对发酵培养基的组成进行了优化,确定了发酵培养基的组成:初始糖为90 g/L、豆粕为4.0 g/L和FeSO4.7H2O为0.08 g/L;以此发酵培养基在37℃下发酵60 h,丁醇产量平均可达到17.02 g/L,总溶剂量达到29.39 g/L。

丙酮丁醇发酵的研究进展及其高产策略

从代谢机理的阐明、生产菌种的改良和发酵工艺的改进3个方面综述了丙酮丁醇发酵近年来的研究进展。针对丙酮丁醇发酵工艺中存在的问题,提出高丁醇耐受性菌种的选育、高丁醇比例菌种的选育、发酵细胞的高效利用、发酵与高效低能耗分离工艺的耦合等高产策略。

甘蔗汁发酵生产丙酮丁醇的研究

选取8株Clostridium acetobutylicum对甘蔗汁的丙酮丁醇发酵能力进行了研究,筛选出1株丙酮丁醇产量较高的菌株(C.acetobutylicum 810705),比较了添加玉米、木薯和无机盐对该菌株发酵甘蔗汁为丙酮丁醇的影响,对甘蔗汁的发酵条件进行了正交实验,并对将甘蔗汁转化为丙酮丁醇的过程进行了初步研究。结果表明:C.acetobutylicum810705转化甘蔗汁生产丙酮丁醇的能力较好,其最佳发酵条件为:温度37℃,糖质量浓度7.5%,木薯与糖的比例1:1.5,通氧量为微量的氧。丙酮和丁醇的含量分别达到4.6g·L^(-1)和15.4g·L^(-1),丁醇含量比通常发酵的12g·L^(-1)提高了28%,相应的蒸馏能耗将大幅度降低。

稻草酶法水解液的丙酮丁醇发酵

利用丙酮丁醇梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）Ｃ３７５菌株发酵稻草酶法水解液，分别研究了氮源、生长因子、ｐＨ等因素对发酵的影响。结果表明，在稻草水解液还原糖浓度为４．２８％时，总溶剂为１２．８ｇ／Ｌ，溶剂组成：丁醇∶丙酮∶乙醇＝６５．８∶２３．８∶１０．４，溶剂生成率为２９．９％。

一株拜氏梭菌利用甘蔗废糖蜜发酵生产丙酮丁醇

以甘蔗废糖蜜作为原料,利用Clostridium beijerinckii DSM 6422菌株进行丙酮丁醇发酵的初步研究。结果表明:采用H2SO4预处理糖蜜,初糖质量浓度60 g/L,(NH4)2SO42 g/L,CaCO310 g/L,温度30℃,pH 5.5～7.0,接种量6%(体积分数),在5 L发酵罐中发酵培养96 h,总溶剂产量为16.17 g/L,其中丁醇质量浓度为10.07 g/L,总溶剂产率为30.2%,糖利用率为89.3%。

汽爆秸秆膜循环酶解耦合丙酮丁醇发酵

利用新型的汽爆玉米秸秆膜循环酶解耦合发酵系统进行了丙酮丁醇发酵的研究,并对使用该系统所导致的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum AS1.132)代谢的变化进行了讨论.在稀释率为0.075h-1的条件下,丁醇的产量为0.14g/g(纤维素+半纤维素),最大丁醇产率达到0.31g/(L-h),溶剂组成为丁醇:丙酮:乙醇65.3:24.3:10.4(体积比),纤维素和半纤维素的转化率分别为72%和80%,使用单位纤维素酶所产生的丁醇量为3.9mg/IU,是分步水解批次发酵的1.5倍.利用该系统使酶解和发酵分别在各自最适的条件下同时连续进行,减少了纤维素酶的用量,有效地解除了酶解产物对纤维素酶的抑制作用,并减轻了溶剂产物尤其是丁醇对微生物活性的影响,延长了发酵周期.

不同C源对丙酮丁醇梭菌产丁醇的影响

对丙酮丁醇梭菌在以葡萄糖、木糖、蔗糖、混合糖、玉米芯酸解糖液分别作C源的P2培养基中的产丁醇状况进行研究。结果表明:不同C源对丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇有显著的影响;葡萄糖为底物时,丁醇产量最高达到13.50 g/L,总溶剂为19.66 g/L;蔗糖为底物时,丁醇所占比例都在70%以上,丁醇产量可达12 g/L;木糖、混合糖为底物时,丁醇产量在10 g/L左右;只有丙酮丁醇梭菌I4-28能利用玉米芯酸解糖液发酵产丁醇,丁醇产量为7 g/L。

丙酮丁醇梭菌发酵糖蜜生产丁醇的发酵条件优化

运用单因素试验结合正交设计法优化丙酮丁醇梭菌发酵甘蔗糖蜜生产丁醇的发酵条件,并进行验证试验。得到发酵条件的最优组合为(NH4)2HPO4的添加量为0.3%,H2NCONH2的添加量为0.1%、Na2HPO4的添加量为0.5%,KH2PO4的添加量为0.5%,L-半胱氨酸盐酸盐-水物的添加量为0.025%,蛋白胨的添加量为0.9%,NaH2PO4的添加量为0.1%,优化后发酵的丁醇产量为11.0536g/L,比原始菌株提高了23.58%。这对糖蜜多途径综合利用有一定的推动作用。

糖蜜发酵生产丙酮丁醇的研究

分离选育出４株丙酮丁醇发酵菌种，分别编号为：ＣＬＳ．００１，００２，００３，００４，都属厌氧梭状芽孢杆菌，它们可利用糖蜜发酵产生丙酮和丁醇。经正交试验，选出最佳发酵条件。分离株ＣＬＳ．００４在糖蜜浓度１０～１５ＢＸ、３５～３８°Ｃ、ｐＨ６．８～７．２条件下，发酵总溶剂的生成率和糖利用率分别可达到３０％和８５％以上。

perR基因的敲除对丙酮丁醇梭菌摇瓶发酵的影响

为了提高丙酮丁醇梭菌对分子氧的耐受能力,降低厌氧发酵环境,构建了超氧化物阻遏蛋白(PERR)基因敲除的工程菌株。应用Ⅱ组内含子敲除系统,PCR克隆perR-Targetron基因与载体连接构建敲除质粒pSYperR,电转化丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC 824,PCR筛选验证获得突变菌株C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR,采用摇瓶发酵对其突变菌株进行发酵性能研究。结果表明:静止状态发酵丁醇C.acetobutylicum ATCC824-ΔperR比C.acetobutylicum ATCC 824丁醇产量提高7.89%,摇床转速为200 r/min时,C.acetobutylicum ATCC824-ΔperR的丁醇产量是C.acetobutylicum ATCC 824的3.34倍。研究表明,通过Ⅱ组内含子敲除系统,构建的C.acetobutylicum ATCC824-ΔperR在发酵过程中降低了氧分子的伤害,不需要严格的厌氧条件,从而降低发酵成本。

丙酮丁醇梭菌发酵玉米秸秆生产丁醇

以丙酮丁醇梭菌为发酵用菌株发酵水蒸气爆破玉米秸秆酶解上清液生产丁醇,研究了酶解上清液浓度、初始pH值以及菌液接种量对丁醇产量的影响,并通过正交试验来确定营养元素的最佳添加量.结果表明:在丙酮丁醇梭菌发酵水蒸气爆破玉米秸秆酶解上清液生产丁醇的最佳条件下(上清液糖浓度57.5g/L、初始pH值6.3,菌液接种量6%,发酵温度37℃,营养元素酵母膏、乙酸铵、磷酸二氢钾、烟酰胺添加量分别为0.8、6.0、0.5、0.25 g/L),丁醇产量达9.726 g/L;水蒸气爆破玉米秸秆酶解液中有抑制产生溶剂的物质,少量烟酰胺能有效促进丁醇生产.

丙酮丁醇梭菌高耐丁醇突变株的选育及其生理特性的研究

丁醇在发酵培养基中的积累所产生的毒性问题是限制丁醇产量的重要因素,然而对于如何提高丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum丁醇耐受性,目前尚缺乏有效的方法。利用紫外线-氯化锂复合诱变技术获得了一株丁醇的耐受性提高了46%的丙酮丁醇梭菌突变株M6,通过比较野生型菌株C.acetobutylicum DSM 1731和突变株M6在不同丁醇胁迫条件下的生理特性,发现突变株M6比野生型菌株具有更好的抵抗丁醇胁迫能力;进行控制pH的分批发酵研究发现,突变株M6的溶剂总产量提高了21.3%,其中丁醇和丙酮的产量分别提高了30.4%和8.3%。表明能够通过紫外线-氯化锂复合诱变技术将C.acetobutylicum高耐受丁醇和高产丁醇的性能集中于同一菌株,这为选育既耐受较高浓度的丁醇又高产丁醇的工业化C.acetobutylicum菌株奠定了基础。

影响丙酮丁醇发酵的主要因素及解决方案的研究进展

制约丙酮丁醇发酵工业化生产的主要问题是丙酮丁醇梭菌在发酵过程中孢子的形成、溶剂产量低、副产物的生成以及丁醇对菌株的毒性等因素。此外,使用木质纤维素等廉价、环保的原料作为发酵底物生产生物丁醇也是目前研究的热点之一。本文就以上问题综述了近年来的研究进展,如孢子形成的分子机制及解除孢子形成与溶剂生成之间联系的途径,丁醇抑制梭菌细胞生长的机制及降低丁醇毒性的方法,通过基因工程改造减少副产物的生成,增加丁醇产量等,并讨论了进一步改造菌种及降低生物丁醇成本的策略。

丙酮丁醇梭菌发酵条件优化研究

以P2培养基为基础组分,分别通过改变初始葡萄糖浓度、初始酵母膏浓度以及初始pH值,研究这3个单因素对丁醇发酵的影响,确定了培养基的较佳条件:初始葡萄糖浓度60g/L、初始酵母膏浓度3g/L、初始pH值6.8。此外,采取接种量5%、发酵温度37℃、发酵时间72h,可使总溶剂浓度(丁醇、丙酮、乙醇)达到13.52g/L,其中丁醇、丙酮、乙醇浓度分别为8.83g/L、3.90g/L和0.79g/L,丁醇比例为65.31%。糖丁醇转化率为21.1%(平均值),糖总溶剂转化率为31.3%(平均值)。

丙酮丁醇梭菌XY16丁醇发酵特性

以诱变选育的1株突变菌株丙酮丁醇梭菌XY16为对象,对影响该菌发酵特性的相关因素(N源、生长因子、热激)进行研究。结果显示:无机N源乙酸铵比其他N源更有利于丙酮丁醇的发酵,玉米浆或玉米蛋白可以直接替代生长因子进行丙酮丁醇发酵,热激可以提高总溶剂产量,最高可以达到21.28 g/L。该菌还可以同时利用葡萄糖和木糖,当葡萄糖利用完后,木糖才能被有效利用。

丙酮丁醇梭菌发酵小麦麸皮生产丁醇

对丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)8016发酵小麦麸皮或麸皮混合其他非粮淀粉质原料生产丁醇进行了研究。实验结果表明,当初始糖浓度为55g/L时,以纯麸皮为底物,发酵终点总溶剂达到21.43g/L,丁醇13.08g/L,糖醇转化率39.57%;以麸皮混合红薯、木薯为底物,发酵终点总溶剂达到22.37g/L,丁醇13.24g/L,糖醇转化率为39.95%,均能达到传统玉米醪发酵丁醇水平。证明小麦麸皮作为一种粮食加工废弃物完全可以替代粮食用于丙酮丁醇发酵。

高产丙酮丁醇梭菌的诱变筛选及特性研究

使用亚硝基胍对实验室保藏的丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum进行诱变,并结合外源添加丁醇的平板培养基对诱变菌株进行筛选,得到一株高产丁醇菌株。以60g/L葡萄糖为底物,37℃,发酵60h,该菌株丁醇及总溶剂产量分别比对照菌株提高了39.3%和48.4%。为了使溶剂产量最大化,针对不同底物浓度对溶剂产量的影响进行研究。结果表明,诱变菌株在利用80g/L葡萄糖为底物,发酵70h,得到最大总溶剂产量23.47g/L。